《离子交换层析纯化与丙酮沉淀》由会员分享，可在线阅读，更多相关《离子交换层析纯化与丙酮沉淀（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,离子交换层析简介,概念： 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，其结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。,2,离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。,纯 化 原 理,离子交换剂固定相,纤维素 0(CH2)2-NH+(CH2H5) OH-
2、基质 电荷基团 反离子 （平衡离子）,3,离子交换剂的电荷基团能够吸附溶液中的相反离子。若溶液中的 反离子对电荷基团的结合力比平衡离子强，则置换出平衡离子，与电 荷基团结合，这样溶液中的相反离子与平衡离子发生交换从而被离子 交换剂吸附。这个过程是可逆的。改变洗脱条件又能把被吸附的离子 交换下来。能吸附正离子基团发生交换作用的，称为阳离子交换剂； 能吸附负离子基团发生交换作用的称为阴离子交换剂。离子交换反应 可以表示为 阳离子交换反应： ( R-X)-Y + A ( R-X)- A + Y 阴离子交换反应： ( R-X+)- Y-+ A- ( R-X+)- A- + Y- ( R-X)-：离子交
3、换剂 Y： 平衡离子 A： 溶液中的离子基团,纯化原理,4,从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。,溶液中的正离子,溶液中的负离子， 代表负电量大小,平衡离子,纯化原理,5,阴离子交换剂的电荷基
4、团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。洗脱曲线呈基线状态。,固定相,平衡液,洗脱曲线基线,纯化原理,6,待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出，在洗脱曲线上出现杂蛋白峰。,加 样,纯化原理,洗脱曲线杂蛋白出峰,7,溶液中的负电基团结合到离子交换剂上。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合力与它们的等电点与缓冲液pH有较大关系。对于阴离子交换剂来说，在一定的pH缓冲液中，等电点越
5、小的蛋白与离子交换剂结合力越强。,平衡液,纯化原理,洗脱曲线,杂蛋白峰,8,通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，结合力小的负电基团先被置换出来，结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。,洗 脱 液,纯化原理,洗脱曲线各组分洗脱峰,9,洗脱液中的反离子将结合在离子交换剂上的各种负电基团置换出来，检测仪输出回复基线状态。如此便完成了一个层析过程。,洗 脱 液,纯化原理,10,离子交换剂的种类和
6、性质,11,在分离纯化生物大分子方面，离子交换纤维素使用较多，其中以DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）和CM-纤维素（羧甲基纤维素）最常用，它们在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。 本实验使用的DEAE(二乙氨乙基)-纤维素DE-52，是弱碱性阴离子交
7、换纤维素。其结构如下：,纤维素 0(CH2)2-NH+(CH2H5) OH- 基质 电荷基团 反离子 （平衡离子）,离子交换剂固定相,12,操作要点,1.离子交换剂的前处理 离子交换剂使用前一般要进行再生和转型处理。首先将干粉在水中充分溶胀，用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的NaCl，这
8、样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。这就是离子交换剂的再生过程。使用过的离子交换剂通过再生处理，可以使其恢复原来性状，反复使用。 离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。本实验使用的DEAE(二乙氨乙基)-纤维素，在酸碱处理再生后，用0
9、.02mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型。以HPO4取代DEAE中的OH。,13,2. 装柱 装柱操作过程和要求与凝胶过滤层析相同。离子交换用的层析柱 一般粗而短，不宜过长， 直径和柱长比一般为1:10到1:50之间。 3. 平衡缓冲液和洗脱缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。洗 脱液是在杂蛋白完全流出后，进行目的蛋白洗脱时使用的缓冲液，通 常有在平衡液的基础上增加离子强度或改变pH两种方式。平衡液和洗 脱液的使用顺序不能颠倒。 4. 上样量 离子交换层析的加样量与柱床体积没有直接关系，但与离子交换剂 的总交换容量有关，还与样品中目的蛋白的吸附性能和浓
10、度有关。加样 量可以通过一些简单的方法测定也可以参考相应的交换容量。一般来说 上样量为总交换容量的40%。 5. 上样操作：基本上与凝胶过滤层析相同，但是在有效成分与固定相之间的 离子交换吸附有一个过程，所以上样流速不宜过快。,14,鸡卵粘蛋白的离子交换层析纯化,CHOM的分子是由4个亚基组成的，其等电点在pH3.94.5之间，分子量为2.8 104。在PH6.5的缓冲液中带负电荷，能被弱阴性离子交换剂DEAE纤维素吸附。由于吸附力较弱，通过提高洗脱液中盐离子的强度，可以将CHOM洗脱下来，由此达到纯化目的。,15,主要仪器 恒流泵 紫外检测仪 N2000生化工作站软件 布氏漏斗、抽滤瓶 循环
11、水真空泵 10200mm 层析柱 材料 DEAE-52离子交换纤维素 样品 凝胶过滤层析脱盐液 试剂 离子交换剂再生： 0.5mol/L HCl 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 平衡液： 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液 洗脱液： 0.3mol/L NaCl0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液,试剂和器材,16,离子交换剂的前处理,抽干后转移至烧杯中用100ml 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液室温下浸泡20min,布氏漏斗中抽滤，用蒸馏水洗至中性（大约PH8即可）,抽干后转移至烧杯中，用100ml 0.5mol/L HCl浸泡
12、20min,布氏漏斗中抽滤，用蒸馏水洗至中性（PH6-7即可）,抽干后转移至烧杯中，用100ml 0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液浸泡，脱气后装柱。,称10g DEAE纤维素粉（DE-52），用过量的水倾去悬浮的细颗粒，转入布氏漏斗中抽滤,17,装 柱,装柱操作过程和要求与凝胶过滤层析相同。 垂直安装好层析柱，检查是否堵塞或漏液。 往柱内加入1/ 4 平衡液，将处理好的离子交换剂全部装入柱内。打开恒流泵，以1ml / min 的流速输入平衡液，让离子交换剂沉降。沉降好的柱床高度约7-8厘米。注意柱床面留有3-4厘米高的平衡液，以免柱头滴下的液体冲坏柱床表面。,18,检测仪器的准备,打开
13、紫外检测仪预热。按照“N 2000 生化工作站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查看”观察基线，基线平稳后即可上样。,19,加 样,关闭恒流泵，关紧止水夹，小心地吸去柱上多余的液体，凝胶床面上留下薄薄的一层液体即可。 用滴管将已经脱盐的CHOM粗提取液上柱吸附。待样品全部进入固定相后，加入0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液并点击软件的“数据采集”。,20,洗 脱,中性和酸性杂蛋白不被吸附，随平衡液流出，在洗脱曲线上绘出杂蛋白峰。继续以平衡液流经柱子，当杂蛋白峰完全下降，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线后，改用含0.3mol/L NaC
14、l的0.02mol/L，PH6.5磷酸洗脱液洗脱。鸡卵粘蛋白在DEAE纤维素离子交换柱层析上分离图如下：,洗脱体积/ml,鸡卵粘蛋白在DEAE-纤维素离子交换 柱层析上的分离图,21,洗脱峰收集,收集第洗脱峰。收集的体积一般在25-30ml为宜。如果在前面的提取过程中，条件控制得适宜，提取的鸡卵粘蛋白是较纯的，有可能不出现卵清蛋白峰（峰II）。,尽量收集洗脱峰浓度较高的峰顶部分，利于下一步的丙酮沉淀。,22,回收离子交换剂，方法与凝胶过滤层析实验相同。 保存样品，准备脱盐和丙酮沉淀纯化。,23,这一步骤不但继续纯化经离子交换层析制备的鸡卵粘蛋白，还起到浓缩的作用，利于后续的偶联工作。,鸡卵粘蛋
15、白纯品的制备 丙酮沉淀,24,试剂： 丙酮（A.R） 透析袋（2.7cm） 仪器： DELTA320型酸度计 低速离心机 磁力搅拌器,试剂和器材,25,透析是最简便的脱盐方法。把专用的半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，由于袋内外溶液浓度的差异形成扩散压，样品溶液向袋外扩散。大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。不断地更换袋外液，袋内的小分子就能不断地扩散出去，最后达到脱盐的目的。,丙酮沉淀前需要将收集的洗脱峰溶液脱盐。脱盐的方法用透析。,半透膜,大分子,小分子,透析简介,26,目前最常用的透析
16、袋是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析袋，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。 商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，也可使用。使用后的透析袋洗净后可存于4蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。 检查透析效果的方法是：用1 B
