层析分离纯化技术-课件

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1、1,层析分离纯化技术,2001.11.28 Shanghai Pudong,2,蛋白质纯化策略,融合蛋白质,非融合蛋白质,表达,简单纯化,一步 亲和层析,90 - 97 % 纯度,更高纯度,三步纯化策略,粗提 中度纯化 精细纯化,多步纯化,3,简易纯化选择,载体和标记 纯化 pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶 GST MicroSpin Purification Module, GSTrap, Glutathione Sepharose Fast Flow PQE 6 x 组氨酸 His MicroSpin Purification Module pET HisTrap, HiTrap Chela

2、ting, 6 x组氨酸 Chelating Sepharose Fast Flow pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow,4,GST 融合蛋白的纯化,GST,重组蛋白,酶切位点 Factor Xa: Mr 17-20 000 / 28-30 000 Thrombin: Mr 37 000 PreScission Protease: Mr 46 000,Glutathione Sepharose,Mr

3、 26 000,10C,5,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料 一次可纯化 GST 注意 融合蛋白的量 GST MicroSpin 400 g 立即可用, 预装柱, Purification Module 缓冲液和试剂 和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理 48 样品) GSTrap 1 ml 10 - 12 mg 立即可用, 预装柱 GSTrap 5 ml 50 - 60 mg 立即可用, 预装柱 Glutathione Sepharose 4B 8 mg / ml 可自行装柱 Glutathione Sepharose 4 10 -12 mg

4、 / ml 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， Fast Flow 适合放大,6,GST MicroSpin Purification Module,立即可用, 50 预装柱含缓冲液和所需试剂 可纯化每柱 400 g, 体积达400 l 样品,适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化,7,GSTrap 柱,20 分钟内 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统 添加剂兼容,适合快速和重复性高的要求,8,GSTrap,结合缓冲液平衡,加样后用结合缓冲液冲洗,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱,收集组份,3 min,5-15 min,2 min

5、,9,GSTrap,SDS PAGE analysis,柱: GSTrap 1 ml 样品: 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 结合缓冲液: PBS, pH 7.3 洗脱缓冲液 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 还原谷胱甘肽 流速: 1 ml/min 层析 步骤: 4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) 系统: KTAexplorer 10,1: 低分子量标记 (LMW) Calibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech

6、 2: 胞浆萃取液, 1 g /10 ml 3: 洗脱GST 融合蛋白,10,Glutathione Sepharose Fast Flow,适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用，并用作放大,每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 装在 XK 空柱中和 KTA 平台纯化系统连接使用 高流速 兼容尿素，盐酸胍等,11,GST 融合蛋白的检测,检测方法 注意 GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒 适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用 GST 酶测定检测模组 快速测定；适合筛选用途 功能测定 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需

7、要自行设计和优化,12,GST融合蛋白的检测,检测方法 注意 使用抗-GST 抗体和 高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 ECL 检测系统的 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus. SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 纯度讯息. 考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.,13,GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒,快速酶测定 每块板可检测 50 样品 适合筛选表达系统和层析组份,14,(His)6

8、融合蛋白的纯化和检测,重组蛋白,His,His,His,Ni2+,His,His,His,His,Ni2+,Ni2+,Ni2+,15,任何规模纯化都比较简单,预装柱/填料 一次可纯化 注意 融合蛋白的量 His MicroSpin 100 g 立即可用, 预装柱, Purification Module 缓冲液和试剂 和 MicroPlex 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理 48 样品) HiTrap Chelating 1 ml 12 mg 立即可用, 预装柱 HisTrap Kit 12 mg/柱 含预装柱和足够 12 纯化的缓冲液 HiTrap Chelatin

9、g 5 ml 60 mg 立即可用, 预装柱 Chelating Sepharose Fast Flow 12 mg/ml 自行装填到空柱和放大用,16,His MicroSpin 纯化模组,立即可用, 50 预装柱连缓冲液和试剂 每柱可纯化达 100 g, 体积达 400 l 样品,适合蛋白质扩增系统的筛选和优化，小规模纯化,17,HisTrap Kit,每根 HiTrap Chelating 金属螯合柱可在少於 25 分钟中纯化 12 mg 融合蛋白 包含所需浓缩缓冲液和工具 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统 添加剂兼容,快速，重复性好和容易使用,18,HiTrap Chelating

10、,准备柱子 用 H2O 洗 加 NiSO4 再用 H2O 洗,加样 用平衡缓冲液冲洗柱子,废液,收集,用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白,收集组份,3 min,5-15 min,2 min,用平衡缓冲液平衡柱子,废液,3 min,19,HiTrap Chelating,SDS PAGE,样品: 5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶， GST-(His)6 柱: HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+ 结合缓冲液: 1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4 洗脱缓冲液: 1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4 流速: 2 ml/min, 312 c

11、m/h 结果: 洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg,1: 低分子量标记 (LMW) 2: 样品稀释 1:20 3: 穿透稀释 1:10 4: 冲洗液 5: 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:20 6: 洗脱 GST-(His)6,稀释 1:10 7: GST 标准品, 0.5 mg/ml 8: LMW,20,Chelating Sepharose Fast Flow,适合自行装柱和放大,每毫升填料可纯化高达 12 mg 融合蛋白 装在 XK 空柱中和 KTA 平台纯化系统连接使用 高流速 兼容添加剂,21,检测 (His)6 融合蛋白,检

12、测方法 注意 ELISA 测定标记 IgG 高特异性，只检测 (His)6 融合蛋白 功能测定 可有效评估纯化出来的 (His)6 融合蛋白是否具备 活性 不一定能买到 可能需要自行设计和优化,22,检测 (His)6 融合蛋白,检测方法 注意 使用抗-His 抗体和 高度特异, 只检测 (His) 6 融合蛋白 ECL 检测系统的 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 免疫印迹法 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus. SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 纯

13、度讯息. 考马氏染色或银染 可检测融合蛋白和污染物.,23,其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (1/3),如果有对应配基，使用亲和层析 一步纯化 高灵敏度 高载量,24,其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (2/3),立即可用的 HiTrap 柱,应用 预装柱 抗体分离 所有来源的 IgG，其亚族，和片断 HiTrap Protein A 和 HiTrap rProtein A 包括人源IgG3 ，小鼠 IgG1和大鼠 IgG HiTrap Protein G 的 IgG，其亚族，和片断 腹水，血请，体液，和细胞培养液的 MAbTrap GII (HiTrap Protein G column (1

14、 ml), 单克隆和多克隆 IgG 工具, 浓缩缓冲液) 鸡蛋请的 IgY HiTrap IgY 单克隆和人源 IgM HiTrap IgM,25,其他融合 或 非融合蛋白的纯化 (3/3),立即可用的 HiTrap 柱,应用：基团特异填料 预装柱 白蛋百, 多种核酸依赖酶, HiTrap Blue 凝血因子, DNA 结合蛋白, a2-巨球蛋白 外露氨基酸: His (Cys, Trp) HiTrap Chelating 的蛋白和多肽 e.g. a2-巨球蛋白和干扰素 生物素和含生物素物质 HiTrap Streptavidin 凝血因子, 脂蛋白酶， HiTrap Heparin 胆固醇受

15、体, 激素, DNA结合蛋白, 干扰素,蛋白质合成因子 活化好的亲和柱自行挂上配基 HiTrap NHS-activated 偶连一级氨基,26,其他融合 或 非融合蛋白的纯化,准备配基 (e.g. 抗体) 准备柱子 (e.g. NHS-activated HiTrap) 现成方法 优化结合和洗脱条件 使用针筒，蠕动泵，或者 KTA 系统操作的 HiTrap 小柱,制作一支特异亲和纯化柱,27,其他融合 或 非融合蛋白的检测,生物活性,Native PAGE IEF MS,分子大小 蛋白质酶切,SDS-PAGE 免疫印迹 MS,N-端测序,聚合物 差异性,pH 稳定性, 离子强度, 蛋白质和 清洁剂浓度,结构变异 N-端差异,28,去处小分子,纯化后 (His)6 融合蛋白的咪唑 酶切后的 GST 或 His 标记 多余的盐/尿素/盐酸胍 用 HiTrap Desalting 将样品转移到另一种缓冲液中，e.g. 储存用或改变 pH,29,交换缓冲液和去盐的柱子,快速有效 高处理量 去盐, 交换缓冲液, 去掉低分子量物质,柱子 样品体积 样品洗脱体积 MicroSpin G-25 0.1-0.15 ml 0.1-0.15 ml HiTrap Desalting 0.25-1.5 ml 1.0-2.0 ml HiPrep 26/10 Desalting 2