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1、HRM建议标准优化流程LC480甲基化处理怡*亚硫酸钠处理强度受很多因素影响,七伴随DNA片段化,冈此对样品量操作时间等诸多操作细节有严格限制*建议采用商品化试剂盒进行甲基化处理与后续纯化“例如Qiagen的kit提供DNA保护缓冲液,显著降低了对样品量与操作时问的苛刻限制*样品处理后建议再测一次0D0值,HRM的样品浓度值不宜太EHRM的PCR扩增基本要求*耍求Hotstart,最好5min以上HIRM往往是大批量样品,PCR加样时间较长Hotstart可以避免长时间加样导致的非特弃性PCR扩增闰题“饱和荧光染料,最好耐受光淬灭“快速PCR试剂不适合HRM的PCR要求q酶的PCR扩增性能和保
2、真性能很难同时保证HIRM本质是检测宋变,囚此要尽量避免在PCR扩增过程中引入突变LC480HRMMasterMix20/10/5u1反应体系灵敏度15%LC480HRMMasterMix“10ul或20u1体系都可以,所有体系按比例配制即可“加下20微升体系10德升体系HRmix10ulHRLmixEMe离二2.4u1Me离二1.2u1引物F0.2u引物F0.lul引物R0.24引松0.uDNh10ngD8h5ng补水到20u1补水到10ulLC480HRMMasterMix10ul体系“注意该处调为10ReactionVolume|8_rneEooporoyrFrrsrrrrs一一一一“一
3、一一E国国园国0TouchdownPCR/触底PCR4*免于实验条件的摸索优化*避免引物二聚体与非特异性扩增的出现“设计引物预期Tmt3度作为起始退火温度,每个循环降低0.5或1度,直至53度TouchdownPCR/触底PCRWWW王TouchdownPCR/触底PCR工作原理“高退火温度时,PCR扩增的特异性好,但效率何低退火温度时,PCR扩增的效率高,但特异性低前面几个循环先保证PCR扩增特异性,优先合成较多特异性PCR亦物后面的循环由于特异往楼松增多,降低汰火温度也有给好牵异性后面儿十循环低退火温度,确保命低引物浓度推荐0.2uM,建议0.1“0.3uM“低引物浓度,避免引物二聚体与非特异性扩增“对Mg“浓度等因素的抗干扰能力更强“PCR扩增需要更多循环数,建议5055cycles
