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1、胶体金常用的生物材料种类及检测反应模式，结果判读模式的介绍,内容,胶体金常用的生物材料种类 检测反应模式 结果判读模式,胶体金常用的生物材料种类,胶体金检测是一种免疫测定，免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。 胶体金常用的生物材料主要是指抗原和抗体。,抗原,抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。 抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epito
2、pe）。一个抗原分子可带有不同的决定簇。,用于胶体金检测的抗原抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类 。,天然抗原,天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。,重组抗原,重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。 重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于胶体金，在反应
3、中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。,重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV 胶体金中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。,合成抗原,合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的
4、吸附，间接地结合到固相载体表面。,应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。,另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。,抗体,抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。,IGg,IGM,IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000,机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，
5、然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 IgM抗体一般为保护性抗体，具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。,抗体按制备过程和抗体性质可分为单克隆抗体和多克隆抗体。 单克隆抗体是通过单组细胞分泌出来的抗体，最终以小鼠腹水形式出现，经纯化，成为可使用的IGg类型的生物材料。 多克隆抗体是指有多组细胞分泌的抗体，一般为二抗，如羊抗鼠等。,还有一种多抗，在免疫动物时当成免疫抗原来使用，即鼠IGg，羊IGg等通过取动物血，再经纯化得到的材料，此类生物材料和二抗配套使用。,单抗的优点是特异性
6、好，但灵敏度可能较差，而多抗的优点是灵敏度度好，结合能力强，但特异性较差。 我们可根据具体情况选择使用的材料。,公司目前使用的材料介绍,重组抗原类：HIV包被、标记，HCV包被、标记，TP包被、标记等 天然抗原类：Sb标记等 合成抗原类：毒品类包被抗原 单抗类：Sg，eAg，HCG等品种的包被标记的材料 多抗类：C线材料，A线材料，抗红细胞抗体（锁血用），抗人IGg,有时公司为了节省成本，将部分单抗的腹水先购回，再自行进行纯化，这类材料多了一个纯化步骤，拉长了生产周期。 如PF，流感。 多抗类的材料也可以通过购买血清进行纯化使用。,二、检测反应模式,检测目标物为抗原 抗原检测是最快捷，最直接的
7、得到结果的方式，但每一种目标物抗原存在的位置各异，在现在的体液检测标本中不易分离出来（如病原微生物寄生于细胞内，HIV,HCV等），故只是部分项目采用了抗原检测。如Sg等。,检测目标物为抗体 一些抗体检测是为了监控抗体水平而进行的直接检测，如Sb；但是相当多的抗体检测是为了看到病毒抗原的水平而进行的。当病毒侵入人体一段时间后，会产生相应的抗体，而抗体在血液中极易得到，故很多无法提取到抗原的项目，可以通过抗体的水平来反映病毒抗原的状况。如HIV/HCV/TP等。,但是抗体检测最大的问题是窗口期较长，诊断的时间较晚，容易耽误病情。,在抗体检测中，还有IgM的检测。由于机体被病毒感染后，先产生IgM
8、抗体，然后产生IgG抗体；经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在。所以通IgM的检测对于一些急性和需要早期诊断的疾病具有重要意义。如甲肝。,而人IgG的检测主要用于流行病学调查抗感染性疾病的恢复期诊断或疫苗接种后的免疫效果的观察。,基本的反应模式,夹心法：双抗原夹心，双抗体夹心 间接法：间接法（测总抗体或IgG抗体），捕获法（测IgM） 竞争法：竞争法测抗原，竞争法测抗体,夹心法,双抗原夹心法 用特异性抗原进行包被和标记，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高，特异性也较强。 同时双抗原夹心法能检测总的抗体量，即IgM,IgG,I
9、gA等的量；既可检测人血清抗体，亦可检测动物血清抗体，对人兽患病的检测更有价值，实现了同一种试剂测不同种属抗体。 但需要注意HOOK效应。,HOOK效应 此现象在标本受检抗原/抗体的含量很高时出现。具体原因是：抗原/抗体在和标记抗体/抗原结合的同时，过量的抗原/抗体也和包被抗体/抗原结合，从而将一部分的结合位点占住，导致前段形成的复合物一部分不能结合到包被膜上，出现了显色变浅的情况。,用高亲和力的单克隆抗体或抗原制备此类试剂可削弱钩状效应。,双抗体夹心法 用特异性抗体进行包被和标记，以检测相应的抗体。标记抗体由于起到了捕抓的功能，加上标记工艺的影响，要求的纯度也较高，一般使用的是单克隆抗体，而
10、包被端既有单抗又有多抗。,在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。 如抗体的来源为抗血清，包被和标记用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被和标记。这种双位点夹心法具有很高的特异性。,双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和标记抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab）或Fab片段作标记结合物的试剂，由于去除了F
11、c段，从而可消除RF的干扰。,双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。,间接法,间接法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体等）与标本中的目标抗体结合，形成复合物，再层析到检测区和相应的抗原结合，从而显色反应。,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一标记抗抗体建立检测相应抗体的方法。 标记抗体也可使用Protein A,因其能与各种动物血清的IgG反应，所以可用在间接法中进行检测。,间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原
12、包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。,抗原中也不能含有与标记抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。,捕获法 胶体金检测中，一般是通过捕获法检测IgM，其原理是膜上包被特异性抗原，金垫上标记有抗人IgM抗体，通过抗人IgM抗体捕获标本中的IgM抗体，再在膜上结合反应显色。
13、此法常用于病毒性感染的早期诊断。如甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测,间接法一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。,竞争法,竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的标记抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的标记抗体愈少，最后
14、的显色也愈浅。小分子激素、药物等测定多用此法。,竞争法测抗体 其原理为标本中的抗体和一定量的标记抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的标记抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。,竞争法测抗体有多种模式，可将标本和标记抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc 一般采用此法。另一种模式为使用中和抗原，标本中的抗体和标记抗体竞争和中和抗原结合，形成复合物后，再与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。,除了上面提到的几种反应模式外，现在还出现了亲和素系统的结合反应模式，有时间可自行去了解，这里就不一一叙述了。,三、结果判读模式,根据上面提到的几种反应原理，胶体金诊断试剂产生了
15、一些常见的结果判读模式。具体如下： 1）CT线对比进行结果判读，品种有LH,FSH,TSH,PSA。判读方式为：T线比C线深或同等深度，判为阳性； T线比C线浅或不出，判为阴性。,2）T线是否显带进行结果判读 A、T线显带为阳性，不显带为阴性，品种有HCG,HIV,Sg等部分夹心法和间接法产品产品。 B、 T线显带为阴性，不显带为阳性，品种有Cb,eb,毒品类等竞争法产品。,3）半定量模式 除了CT线，还有一条用作半定量的R线，当T线弱于R线时，表明标本浓度小于某个数值；当T线等于或强于R线时，表明标本浓度大于某个数值。此类产品目前有艾康公司研发的PSA，我司暂时还没有此类产品。,随着诊断技术的发展，结果判读也有了更多的一些新的模式，每一种新的模式都可能给这个产品带来新的机会和新的卖点。每一位技术人员都可从基本模式出发，充分发挥自己的主观能动性，设计出更新颖的判读模式，为自己的研发生涯添上光彩的一笔！,谢谢大家！,
