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1、,双水相萃取的原理及应用,Aqueous two-phase extraction,2014210918 康文渊,组员:,NF-B信号通路,刘文荣 王嘉犀 范倩 何亚玲,英英释义,内容 Content,1、双水相萃取的历史,2.双水相萃取的基本原理,3.双水相萃取的特点,4.双水相萃取的应用,ATPE 的历史：,ATPE 的历史：,Beijerinck （？-）,早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性，从而产生了双水相体系(Aqueous
2、two phase system,ATPS)。,ATPE 的历史：,ATPE 的历史：,1956年瑞典lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。,ATPE 的历史：,ATPE 的历史：,Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化。,ATPE 的历史：,ATPE 的历史：,双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及
3、重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。 有机溶剂萃取：以与水互不相溶的有机溶剂作萃取剂从水相中萃取目的产物，广泛应用于抗生素、有机酸、维生素等发酵产品生产。用于蛋白质、核酸、酶等生物大分子的分离很少成功。 反萃取：使用水溶液从有机溶剂中萃取水溶性的物质。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,反胶团萃取：利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团（reversed mice
4、lles），从而在有机相内形成分散的亲水微环境。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,反胶团萃取：使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了生物分子，特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解在有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象。 超临界萃取：,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,以上方法对蛋白质的分离纯化有不同的缺陷。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,到目前为止，双水相技术几乎在所有的生物物质如: 氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等的分离纯化中得到应用, 特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。,ATPE 的基本原理:,
5、ATPE 的基本原理,双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。,ATPE 的基本原理:,ATPE 的基本原理,常用的双水相体系:,ATPE 的基本原理,高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。,常用的双水相体系:,ATPE 的
6、基本原理,PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸钾,DX = 葡聚糖(dextran),常用的双水相体系:,ATPE 的基本原理,PEG/Dx体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，,PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。,ATPE 的基本原理,各种类型的双水相体系,相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系,ATPE 的基本原理,相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系,ATPE 的基本原理,双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线 以下的区域为均相区, 以上
7、的区域为两相区， 即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上连两点的直线。 K点： K点为临界点，表示两相差别消失。,相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系,ATPE 的基本原理,系线反映的信息 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同 的两相。两相体积近似服从杠杆规则 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度, 系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,聚合物分子量的影响： 对于给定的相系统，如果一种高聚物被低分子量的同种高聚物所代替，被萃取的大分子物质,如蛋白质、核酸、
8、细胞粒子等，将有利于在低分子量高聚物一侧分配。,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,聚合物分子量的影响： 如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40（MW 40 000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物质如细胞色素C分配系数增加并不显著。然而，被萃取的大分子量物质，如过氧化氢酶的分配系数可增大到原来的67倍。,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,pH 值的影响：改变两相的电位差 如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH值的变化也会影响磷酸盐的离解程度，导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物
9、质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响: 在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。 同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的 电势差(Donnan电势) ,它是影响荷电大分子，如蛋白质和核酸等分配的主要因素。,影响双水相萃取的因素,ATPE 的基本原理,例如，DNA萃取时，离子组分微小的变化可使DNA从一相几乎完全转移到另一相。,ATPE 的基本原理,离子液体BmimPF6直接萃取DNA,ATPE 的基本原理,基于离子液体BmimPF6的双水相体系直接萃取牛血清蛋白。,双水相的特
10、点,ATPE 的特点,对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化方面的优势： (1)含水量高(7090)，在接近生理环境的体系中进行萃取，避免生物活性物质失活或变性。 (2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或酶），可直接提取细胞内酶，避免破碎或过滤等步骤。,双水相的特点,ATPE 的基本原理,(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min15 min。 (4)界面张力小(10-7 10-4mNm)，利于两相之间的质量传递。 (5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物不易挥发，对人体无害。,双水相的特点,ATPE 的基本原理,(6)大量杂质可与固体物质一同除去。 (7)易于工艺放大
11、和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理。 (8)操作条件温和，在常温常压下进行。 (9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。,双水相的特点,ATPE 的基本原理,虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。,双水相的特点,ATPE 的基本原理,不足之处: 如易乳化、成相聚合物的成本较高、分离效率不高等,双水相萃取的应用,ATPE 的基本原理,双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，为生物活性物质提供了温和的分离环境。它还具备操作简便、经济省时
12、、易于放大。据报道，系统可从10ml直接放大到1m3规模（105倍）,而各种试验参数均可按比例放大，产物收率并不降低。,双水相萃取的应用,ATPE 的基本原理,英英释义,1、蛋白质、酶的纯化,2、多肽的分离纯化,3、核酸的分离纯化,4、其它分离纯化,双水相萃取的应用,ATPE 的基本原理,主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。,双水相萃取的应用,ATPE 的基本原理,1) 蛋白质、酶的纯化 2) 多肽的分离纯化,双水相萃取的应用,ATPE 的基本原理,目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，I
13、-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。,ATPE 的基本原理,以蛋白质的分离为例说明双水相分离过程的原则流程: 包括三步双水相分离, 第一步：所选择的条件应使蛋白质产物分配在富PEG的上相中, 而细胞碎片及杂质蛋白质等进入下相。,ATPE 的基本原理,以蛋白质的分离为例说明双水相分离过程的原则流程: 包括三步双水相分离, 第二步：分相后上相中再加入盐使再次形成双水相体系,核酸和多糖则分配入富盐的下相,杂质、蛋白质也进入下相,而所需的蛋白质再
14、次进入富含PEG的上相。,ATPE 的基本原理,以蛋白质的分离为例说明双水相分离过程的原则流程: 第三步：向分相后的上相中加入盐以再一次形成双水相体系。在这一步中,要使得蛋白质进入富盐的下相,以与大量的PEG分开。蛋白质与盐及PEG的分离可以用超滤、层析、离心等技术。,ATPE 的应用,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,双水相萃取的应用,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,3) 核酸的分离纯化,ATPE 的应用,4) 病毒、细胞器、细胞的分离,ATPE 的应用,4) 病毒、细胞器、细胞的分离,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）中草药成分的提取 甘草、银杏液、黄芩苷等的有效成分分离。 谢
15、涛等利用 PEG 4000/ K2HPO4 组成的双水相体系从三七中萃取三七皂苷,回收率为 96 %。,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）中草药成分的提取 ( 1 )将 PEG和 K2HPO4 配成一定浓度的浓溶液; ( 2)在常温下, 取三七浓缩液置于10ml的离心试管中, 加入一定体积的成相物质浓溶液,振荡摇匀,在离心机中以一定转速离心 5min, 使其分相;,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）中草药成分的提取 ( 3 )分别读取上下相体积, 并取样分析上下相中三七总皂苷的含量。,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）中草药成分的提取,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）
16、中草药成分的提取,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,5）中草药成分的提取,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,6）双水相萃取分析 黄毒苷的免疫测定,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,7）稀有金属/贵金属分离 克服溶剂萃取法的不足。 在聚乙二醇 2000/硫酸按/偶氮胂（shen四声） ( )双水相体系中 ,实现了 Ti ( )与 Zr（锆gao） ( )的分离,双水相萃取的应用,ATPE 的应用,7）稀有金属/贵金属分离 分别在 60 ml 分液漏斗中加入不同 pH 值的缓冲溶液 2 ml , 偶氮胂 溶液 0. 6 ml , PEG 溶液 5ml和一定量的金 属离子溶液 , 用 水定容到 10ml , 再加入 2g 固体(NH4) 2SO 4, 振荡 3 5min , 静置 , 待两相分层清楚后 , 将下层水相放入
