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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果牛膝中对成骨样细胞UMR106有促进增殖作用的活性成分研究 【摘要】 目的寻找牛膝中对成骨样细胞UMR106的增殖有显著促进作用的活性成分。方法运用薄层、色谱技术等方法进行分离，鉴定。结果分离出3个化合物，结晶-谷甾醇、 结晶胡萝卜苷、结晶蜕皮甾酮。结论 牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱等分离手段进行化学分离，得到3种含量较大的化合物。 【关键词】 牛膝 高效液相色谱 -谷甾醇 胡萝卜苷 蜕皮甾酮 牛膝为苋科牛膝Achyrenthes b
2、identata BI的干燥根，主产于河南省，也称怀牛膝，具补肝肾，强筋骨的功能。主治腰膝酸痛，下肢萎软。药 理学 研究表明：牛膝具有保肝、降酶、镇痛、抗炎、增强免疫力及抗衰老作用。其化学成分主要为多糖，齐墩果酸类三萜皂苷和植物甾酮类。根据中医理论，对30种中药提取物进行活性筛选，发现牛膝的甲醇提取物对破骨细胞具有较强抑制作用。进一步研究证实：牛膝正丁醇可溶部分为其活性成分。为了寻找牛膝中显著促进骨样细胞UMR106增殖的活性成分，对牛膝的甲醇提取物的正丁醇可溶部分的化学成分进行研究，分离得到3个已知化合物。 1 材料与方法 仪器、试剂及药品 仪器 J Jasco PU-980高效液相色谱输液
3、泵，Jasco UV-975紫外-可见检测器(日本分光公司)；CKChrom色谱工作站，CX-250超声波清洗器，1H-NMR Bruker ARX-300核磁共振仪。 试剂 乙腈，天津四友生物医学技术有限公司提供；硅胶，青岛海洋化学试剂厂提供。 药材 牛膝购自辽宁省沈阳市中药材公司，经本校药用植物教研室孙启时教授鉴定为Achyranthes bidentata BI之干燥根对照品 -谷甾醇、胡萝卜苷、蜕皮甾酮对照品由本校天然药化研究室李铣教授提供。 药物提取及分离 牛膝药材醋酸乙酯层的提取 取牛膝药材细粉，放入圆顶烧瓶中，用75%乙醇加热回流提取3次，合并滤液，进一步减压回收溶液得到乙醇提取
4、浸膏。浸膏用水溶液，得到水混悬液。混悬液用石油醚萃取，萃取后保留石油醚层，放入棕色瓶中，混悬液用氯仿萃取，得到氯仿层。混悬液用正丁醇和醋酸乙酯萃取，分别得到了醋酸乙酯和正丁醇层及水层。顺利完成了提取工作。 牛膝醋酸乙酯层的分离 取牛膝醋酸乙酯层浸膏适量，用石油醚-丙酮进行梯度硅胶柱层析，溶剂梯度变化顺序为：石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、石油醚-丙酮、丙酮，每个溶剂梯度用5个层析硅胶柱的保留体积洗脱,每250 ml为一馏分，各馏分回收溶剂后，用硅胶GF254薄层板检验各馏分成分，合并主要成分相同的馏分1。 当洗脱溶
5、剂为石油醚-丙酮时，收集馏分60-66，用硅胶制备薄层进行制备，以石油醚-丙酮为展开系统，氯仿-甲醇重结晶得化合物。 当洗脱溶剂为石油醚-丙酮时，收集馏分192-199，经硅胶制备薄层进行制备，以氯仿-甲醇-水为展开系统，氯仿-甲醇重结晶得化合物。 当洗脱溶剂为丙酮时，收集馏分202-214，经硅胶制备薄层进行制备，以醋酸乙酯-甲醇为展开系统，甲醇重结晶，反相高效液相色谱制备，以水-乙腈-四氢呋喃为流动相，得化合物。 含药细胞培养液的配制取从牛膝醇提物的醋酸乙酯层浸膏中分离得到的每种化合物约1 mg 溶于1 ml DMSO中，配成1 mg/ml的储备液，进行细胞的增殖检测实验时，用无血清MEM
6、依次稀释成102，103，104，105，106，10mg/ml个浓度。 结果 牛膝中分离得到的3种化合物的鉴定：化合物：白色针晶，mp 139142，Liebermann-Burchard反应阳性，用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时： 石油醚-丙酮； 环己烷-醋酸乙酯； 氯仿-石油醚-醋酸乙酯，和对照品-谷甾醇Rf相同，和对照品混合后熔点不降低。故鉴定为-谷甾醇(-sitosterol)。 化合物：白色粉末，mp03305，Libermann-Burchard和Molish反应均为阳性，用以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时： 甲醇-醋酸乙酯-冰乙酸；醋酸乙酯-甲醇； 氯仿-甲醇
7、-冰乙酸，其Rf值和对照品胡萝卜苷一致，在以不同比例乙腈-水为流动相的高效液相色谱中，其保留时间和胡萝卜苷对照品相同，鉴定该化合物为胡萝卜苷。 化合物：白色针晶，mp41243，Liebermann-Burchard反应阳性，当以下面3种溶剂系统为展开剂进行薄层色谱时： 氯仿-甲醇-水下层；醋酸乙酯-甲醇； 氯仿-甲醇-冰醋酸，其Rf 值和蜕皮甾酮对照品一致；在以不同比例的甲醇-水、乙腈-水为流动相的高效液相色谱中，其保留时间和蜕皮甾酮对照品相同，证明该化合物为蜕皮甾酮(ecdysterone)2。 胡萝卜苷、蜕皮甾酮对成骨样细胞的增殖也表现出显著的促进作用，当其在细胞培养液中的浓度为10mg
8、/ml时，其促进成骨样细胞增殖的作用最强，3次实验的最高增殖率平均为45%。-谷甾醇对成骨样细胞的增殖既无显著的促进作用又无显著的抑制作用。 讨论 牛膝的醇提物对成骨样细胞UMR106有促进增殖的作用，增殖率可达27%，醇提物的醋酸乙酯萃取部位比醇提物具有更强的促进增殖作用，其增殖率可达55%。本研究以成骨样细胞UMR106的增殖为活性指标，对醋酸乙酯层的成分进行活性追踪和化学分离，发现含量较高的化合物-蜕皮甾酮和胡萝卜苷对成骨样细胞UMR106的增殖具有显著的促进作用，因此，确定蜕皮甾酮和胡萝卜苷为牛膝中对成骨样细胞UMR106的增殖有显著促进作用的活性成分。 对牛膝的醋酸乙酯层用硅胶柱色谱、薄层色谱、反相高效液相色谱等分离手段进行化学分离，得到3种含量较大的化合物，确定它们的结构，然后再分别测试每种化合物的活性。 【 参考 文献 】 1王晓娟，朱玲玲.牛膝皂苷的化学成分研究J.第四军医大学学报，1996，17：427. 2许宏亮，陆善森.长叶牛膝与怀牛膝中蜕皮激素的分离和鉴定J.中成药研究，1981，：35. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
