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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果浅谈促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制11 【摘要】 目的: 研制人血清中促甲状腺素的化学发光免疫检测试剂盒。方法: 采用辣根过氧化物酶标记的抗TSH亚单位特异性单克隆抗体(mAb), 与固相包被的抗TSH亚单位的另一mAb配对, 以鲁米诺作为底物, 采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法。结果: 该方法灵敏度为/L, 批内CV平均为%, 批间CV平均为%, 平均回收率为%。该检测与LH、 FSH和HCG无交叉反应。部分实验样品
2、的测试结果显示该试剂与国外同类试剂的测定结果明显相关(r)。结论: 该方法具有较高的灵敏度、 重复性和准确度, 与其他同类产品相比简便、 快捷、 成本低, 适于临床检测和科研应用。 【关键词】 促甲状腺激素 化学发光免疫分析法 试剂盒 促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素, 由和2个亚基组成, 相对分子质量(Mr)为280001。TSH本身受下丘脑分泌的TSH释放激素TRH的调控, TSH的主要生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌, 血液中甲状腺激素水平与腺垂体分泌TSH的量之间有负反馈抑制关
3、系2。甲状腺功能改变时, TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显, 是反映下丘脑垂体甲状腺轴功能的敏感指标, 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法, 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用3。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒, 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。 1 材料和方法 材料 TSH单克隆抗体(mAb)、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶为Sigma公司产品, 光免板为Thermo Electron公司产品, 化学
4、发光底物为BioRad公司产品。 方法 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中, 配制成含, 1,0, 100 mIU/L的标准溶液。 抗体包被板的制备 将100L含TSH mAb的碳酸盐缓冲液加至包被板中,7包被h, 再用含10 mg/L BSA的 mol/L 磷酸盐缓冲液于37封闭h后晾干备用。 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备, 然后经 mol/L 磷酸盐缓冲液透析过夜后, 加入等量的甘油于-20保存备用。 检测方法 将50 L待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中,7温育30 min, 弃反应液, 用洗涤液洗5次, 加酶标记物50 L,7温育30 min后同
5、样用洗涤液洗5次, 然后加入发光底物于510 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。 2 结果 .1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中, 将不同量的免疫复合物加入发光液中, 发光强度随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值, 在51min内RLU较为稳定, 随后开始缓慢下降。 .2 反应条件优化 . 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50 L和100 L考查标准品RLU, 发现加样量为100 L与50 L RLU相差不大, 说明50 L的加样量反应能达到平衡(图1)。 图1 加样量对RLU
6、的影响 . 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步: 加入标准品和待测样品后, 将反应体系在37分别温育15、0、5、0 min; 第二步: 加入酶标记抗体后, 将反应体系在37分别温育15、0、5、0 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡(图2)。 图2 温育时间对RLU的影响 A: 第一步温育时间对RLU的影响; B: 第二步温育时间对RLU的影响. .3 稳定性 将试剂盒放置于37 d后, 比较与放置前参考标准品各点RLU值, 参考标准品各点RLU值未见明显降低, 且本底发光值无明显升高, 表明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性要求。 .4 方法学评价 . 标
7、准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下, 以标准血清的浓度制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准, 用零标准均值加上2倍标准差, 计算出此方法的灵敏度为/L。 图3 TSH标准曲线 . 精密度 取低(/L)、 中(/L)和高(/L)3种TSH浓度各重复测定10次, 测定批内CV分别为%、.3%和%, 平均为%。隔日分别进行5次独立试验, 测批间CV分别为%、.6%和%, 平均为%。 . 准确性 在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清,测定加入回收率为%。将TSH浓度为/L的血清用标准零血清分别按1/2、 1/4、 1/8、 1/16稀释, 测量各稀释浓度的TSH含量, 测
8、定稀释回收率为%。 . 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、 FSH和HCG后, 对TSH的测定无干扰。 . 与进口试剂的比较 将研制的TSH CLIA定量检测试剂盒与Abbott architect iXX全自动化学发光系统共同对30例正常人、0例甲亢及80例甲低临床标本进行检测, 通过数据分析, 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性(图4)。 图4 与Abbott全自动化学发光系统相关性曲线 3 讨论 血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种4。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产, 而
9、绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式, 并在仪器中人为设置排它性检测程序, 从而抬高了配套试剂盒价格, 增加了检测成本, 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的人血TSH CLIA试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究, 发现其在51min内RLU处于平台期,反应时间选择10 min。其次对反应条件进行了实验摸索, 在不同的温育时间和加样量的条件下, 各RLU值相差不大, 因此选择了50 L的加样量与两步共1 h的反应时间。 我们研制的TSH化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求5; 同时该方法具有操作方便, 反
10、应时间短和成本低等优点, 具有较广阔的市场应用前景。 【参考文献】 1 Hay ID, Bayer MF, Kaplan MM, et al. American thyroid association assessment of current free thyroid hormone and thyrotropin measurements and guidelines for future clinical assaysJ. Clin Chem, 1991,7(11):002-XX. 2 尹东光, 贺佑丰, 刘一兵, 等. 促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究J. 分析化学研究报告,004,:93-896.3 叶成果. 促黄体生成素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制J. 河南科技大学学报,004,2:3-84.4 任均田. 促甲状腺素实验检测进展J. 国外医学放射医学核医学分册,002,6:7-60.5 王永宁, 李荣秀, 李成武, 等. 微粒子化学发光免疫测定促甲状腺素敏感性方法的建立和应用J. 细胞与分子免疫学杂志,004,0:29-631. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
