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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果沙枣花黄酮成分的含量测定及其药理作用的初步研究 作者：王基云，姚遥，肖旭，王锐，陈虎，张振华，王妍 【摘要】 目的参照 中国 药典(XX版)测定沙枣花(Elaeagnus angustifolia blossoms，EAB )中总黄酮和芦丁的含量，并初步探讨沙枣花醇提物(the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms，AE-EAB ) 对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 参考
2、中国药典通过分光光度法和高效液相色谱法测定EAB中总黄酮和芦丁的含量，并通过测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和肝组织匀浆中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及观察肝脏形态学改变，研究不同剂量AE-EAB对小鼠CCl4急性肝损伤模型的保护作用。 结果测得EAB中总黄酮的含量为2mg/g，芦丁的含量为/g。与CCl4诱导的肝损伤模型比较, AE-EAB给药组小鼠血清中ALT,AST活性明显降低(P 【关键词】 沙枣花; 黄酮; 急性肝损伤; 四氯化碳 Abstract：ObjectiveTo determine the cont
3、ents of total flavonoids and rutin in Elaeagnus angustifolia blossoms(EAB)according to Technical Standard For Chinese PharmacopoEia(200version) ,and to study the protective effects of the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms(AE-EAB) on acute hepatic injury induced by carbon tetrachlori
4、de (CCl4) in method and high performance liquid chromatography were used to determine the contents of total flavonoids and rutin in EAB，according to Technical Standard For Chinese PharmacopoEIa(200version). The levels of ALT,AST in serum and MDA , SOD and GSH in liver were measured and the hepatic h
5、istological changes were observed by optical microscope in order to study the protective effects of different doses of alcohol extract of AE-EAB on acute hepatic injury induced by % CClin content of total flavonoids of EAB is7mg/g (7mg total flavonoids in 1g EAB ) , and that of rutin was /g( rutin i
6、n 1g EAB). Compared with model group, the levels of ALT, AST in serum were obviously decreased (P Key words：EAB; Flavonoids ; Acute hepatic injury; Carbon tetrachloride 沙枣花为胡颓子科植物沙枣Elaeagnus an gustifolia L .的花,主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱 ,具有很强的生命力 ,也是宁夏防风固沙的重要植物。沙枣花呈银白色，下垂，花呈漏斗形，长57mm。据中药大辞典记载 ,沙枣花主要含山萘酚、花白素
7、、脂肪油和少量挥发油 ,具有止咳平喘的功能 ,可用于 治疗 慢性气管炎1。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成分2。本研究通过分光光度法测定了沙枣花醇提物中总黄酮的含量, 结果测得沙枣花中总黄酮的含量为27mg/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含总黄酮2mg);通过高效液相色谱法高效液相测定沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量，结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含芦丁)，表明沙枣花中含有黄酮类物质。本文还对沙枣花醇提取物浸膏对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用做了初步研究,为进一步开发应用沙枣花提供一些实验依据。 1 材料与仪器 动物清洁级健康昆明种小鼠,雄性,体质量(2
8、02)g ，由宁夏医科大学动物实验中心提供,动物合格证号: SCXK(宁)XX-0001。 1.试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);甲醇为色谱纯(天津市江天化工技术有限公司),水为超纯水,其它试剂均为分析纯。芦丁标准品(宁夏医科大学药学院提供) 。 1.药材沙枣花采自宁夏医学院旁沙枣林，经宁夏区药品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树Elaeagnus angustifolia L.的新鲜花序。 1.仪器高效液相色谱仪(日立 MODELL-2100/2130)
9、;AllSPhere ODS C18(250 mm)色谱柱;旋转蒸发仪(上海亚荣); SHB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ-3200 DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Mili-Q超纯水仪(法国); 电子 天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温离心机(日立公司 CF16RX);恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。 方法与结果 .1 分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量3 . 对照品溶液的制备精密称取在120干燥至恒重的芦丁对照品50 mg,置于2ml量瓶中,加甲醇适量,置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻
10、度，摇匀。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每毫升中含无水芦丁)。 .1.标准曲线的制备精密吸取标准溶液1，3，4，5，ml置2ml量瓶中,各加亚硝酸钠溶液1. 00 ml,混匀,放置显色min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀，放置min，加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置1min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程Y=,相关系数r=,线性关系良好。 .1.测定法取本品粗粉1g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去
11、乙醚液。再加甲醇90 ml，加热回流至提取液无色，转移至100 ml量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml,至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取ml，置2ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度，测得吸光度值为，从标准曲线上算得供试品溶液中总黄酮的浓度为/ml，即算得沙枣花中总黄酮的含量为2mg/g(即每克沙枣花中含有总黄酮2mg)。 .RP-HPLC色谱法测定芦丁的含量3 . 标准曲线的制备 取芦丁对照品溶液( mg/ml)分别进样,进样体积分别为1，2，4，6，8，10，35，40 l,测定峰面积,以进样
12、量为横坐标,峰面积A为纵坐标,得回归方程为A=109C+19198,相关系数为r=,芦丁在g范围内成良好的线性关系。见图1。 .2.色谱条件色谱柱为ODS C18(4. mm250 mm),检测波长360 nm,柱温为室温(30),流速1. 0 ml/min,流动相为甲醇-水-冰醋酸(352.)。 .2.供试品溶液制备及芦丁的含量测定 取沙枣花粗粉1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率2kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精密量取滤液ml，置2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。用0.m
13、微孔滤膜过滤,进样10 l按“2. ”项下色谱条件注入色谱仪,测峰面积。结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为/g(即每克沙枣花乙醇提取物中含芦丁)。见图2。 .2.沙枣花醇提物浸膏的制备 kg沙枣花切碎后,加3倍量80%乙醇加热回流提取(1 h3),合并滤液,减压浓缩,得沙枣花浸膏。 .2.沙枣花浸膏最大给药剂量的测定4健康昆明种小鼠40只，182g，雌雄各半，分两组，沙枣花醇提物灌胃，/只(最大容积，最大耐受量)，给药前禁食10 h，正常饲水。观察1d，记录小鼠一般状况改变及死亡数。结果发现，给药后1020 min呼吸加快，1 h后呼吸平稳。观察1周未见小鼠外观及行为有任何变化，未见小鼠死
14、亡。因此灌胃最大耐受量为 g/kg。 .诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立4昆明种小鼠60只,雌雄各半,将小鼠随机分成6组,每组10只。分别为正常对照组，CCl4模型组，阳性药(联苯双酯滴丸)对照组(kg-1)、沙枣花浸膏高(1gkg-1)，中(gkg-1)，低(gkg-1)剂量组, 灌胃给药21 d,同时模型组和正常对照组分别给予同体积生理盐水。于第21天给药h后,每鼠ip 10 mlkg-1,% CCl4橄榄油溶液,正常对照组给等量的橄榄油溶液，禁食,不禁水。造模1h后,眼球取血,血液000 rmin-1离心10 min,取血清超低温冰箱-80冻存以备下一步检测所需。采血后,快速断头处死，取肝
15、右叶组织,在冰生理盐水中漂洗,滤纸拭干,用生理盐水制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液待测。同时取左叶肝脏,%多聚甲醛固定作病理切片。 测定指标：血清ALT、AST,按试剂盒要求进行测定;肝组织匀浆SOD、MDA和GSH,按试剂盒要求进行测定;取肝左叶同一部位组织,用常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织的形态学变化。 统计学处理：采用统计软件，数据以s表示。组间采用t检验，P .血清生化指标检测结果表明,皮下注射CCl4可引起小鼠急性肝损伤,表现在血清中ALT, AST活性明显升高。AE-EAB各剂量组均可使其升高的ALT,AST活性显著降低(P .肝组织匀浆生化指标检测 从实验结果
16、可见,模型组小鼠肝组织中MDA含量明显升高(P .肝脏组织病 理学 观察正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地软而富有弹性;在光镜下可以观察到肝小叶结构完整,细胞排列整齐,大小均匀,分界清楚，无炎细胞浸润(图3-A)。模型组小鼠肝脏体积增大,质脆,边缘钝而厚,表面呈黄褐色，有暗红色出血点;镜下见肝小叶结构破坏,肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和大量炎细胞浸润(图3-B)。联苯双酯组(图3-F)和AE-EAB(图3-E)高剂量组肝脏略有水肿,质地柔软;镜下见肝小叶结构基本完整,细胞排列较整齐,只有少量的炎细胞浸润,较模型组有明显改善。AE-EAB(图3-D)中剂量与低剂量组(图3
