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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果正交试验优选蜗牛多糖提取工艺的研究(1) 作者：湛孝东 王克霞 李朝品 【摘要】 目的：探讨蜗牛多糖的最佳提取工艺。方法：运用正交试验对浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素进行优选。结果：蜗牛多糖提取条件的最优组合为：浸提时间6h、浸提温度70、料液比130和乙醇浓度90%。结论：优选的蜗牛多糖提取工艺稳定可行，能有效提高蜗牛多糖得率。 【关键词】 正交试验 蜗牛多糖 提取 优选 多糖是广泛存在于有机体内的一种重要信息分子的受体，它参与分子识别、细胞黏附以及
2、机体防御等过程的调节，使多糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫增强、降血糖、抗凝血和抗衰老等多种生物学活性。此外，多糖大多提取于动植物，是一类毒副作用小的天然药物，因此受到广泛关注。我们发现蜗牛多糖具有抗病毒和增强免疫等活性12。但目前的蜗牛多糖提取工艺存在得率较低的缺点，我们采用正交试验的方法对现有工艺进行了优化，结果报道如下。 1 材料与方法 试剂和议器 试剂：无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、葡萄糖等，以上试剂均为分析纯。仪器：恒温磁力搅拌器，国华电器；电子天平，瑞士Metller；真空干燥箱，上海一恒；UV1600紫外-可见分光光度计，日本岛津。 实验方法 正交试验设计 参照预实验及文献资料，选取浸
3、体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素，每个因素3个水平，采用L9正交表，见表1。表1 因素水平表 多糖提取 新鲜活体条华蜗牛，去壳，清水洗净干燥后精确称取200g，按正交试验设计的因素水平，参考文献方法3，提取蜗牛多糖。 标准曲线绘制及多糖含量测定 采用苯酚-硫酸比色法，操作步骤如下；精密称取105下干燥至恒重的葡萄糖60mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即为葡萄糖标准液。精密吸取上述溶液、和，分别置于50ml容量瓶中，加蒸馏水定容。精密吸取上述溶液各，置试管中，然后各管加入5%苯酚1ml，摇匀后迅速加入浓硫酸7ml，5min后置40水浴中加热30min，取出置冰水浴5m
4、in。以同样处理的蒸馏水作空白。490nm处测定吸光度A。以A值为纵坐标，以葡萄糖标准液浓度C为横坐标，绘制标准曲线。 根据蜗牛多糖吸光度及标准曲线回归方程计算出蜗牛多糖浓度，并计算得出其含量。 结果 .1 正交试验结果 不同浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度正交试验结果见表2。 . 直观分析 从表2可以直观看出浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度对蜗牛多糖得率都有影响，主次因素顺序为：ABDC。蜗牛多糖提取条件的最优组合为：A2B2D3C3，即浸提时间6h、浸提温度70、乙醇浓度90%和料液比130。 . 方差分析 结果见表3。表 正交试验结果方差分析方差分析的结果表明，浸提时间和浸提温度对多糖的
5、得率有显著性影响。 .2 标准曲线方程及多糖含量 不同浓度的葡萄糖标准液对应的吸光度A值分别为、和。计算出的葡萄糖标准曲线的回归方程为：A=，r=。根据葡萄糖标准曲线的回归方程计算出蜗牛多糖含量的平均值为%。 .3 验证试验 精密称取蜗牛3份，每份200g，以上述蜗牛多糖最佳提取工艺进行提取。测得蜗牛多糖 含量平均值为%，RSD=%，验证结果说明该工艺稳定可行。 讨论 在正交设计优选提取条件中，我们得出的最佳乙醇浓度为90%，但是考虑到提取成本的因素，我们实际使用的乙醇终浓度为70%，然后通过反复多次沉淀。这既节约了成本又提高了多糖纯度，效果较理想。 现有文献报道的多糖提取方法大多为植物多糖和
6、菌类多糖，这类多糖的共同特点是成份单一，水溶性较好，因此提取过程较为简单。但蜗牛多糖大部分为蛋白多糖，因此分离较困难，这是蜗牛多糖得率不高的主要原因。此外动物多糖往往还含有脂类，脱脂是否完全直接影响多糖的纯度和得率。本研究参考其他贝类多糖的提取方法，采用甲醇温和脱脂的方法，避免了对多糖结构的破坏，取得了较好效果。 但从实验结果可以看出，同以往文献报道相比4，动物多糖的得率较植物多糖低，可能的因素有两个：一方面动物与植物体内有机物质构成不同，动物的脂肪和蛋白质含量比植物高出许多；另一方面可能是提取方法还不完善。动物多糖特别是贝类多糖的提取工艺还有待深入研究。 【参考文献】 1 湛孝东，王克霞，李朝品，等蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究J时珍国医国药，XX，17：21912192 2 王克霞，湛孝东，李朝品，等江西巴蜗牛多糖对乙肝病毒复制的抑制作用研究J中国药理学通报，XX，22：3783793 张 璐，刘 强茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展J中国实验方剂学杂志，XX，12：61644 苏延友，苏延峰，杨杰正交试验法优选黄伞多糖提取工艺的研究J食用菌，XX：10 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
