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1、项目名称：儿童孤独症的遗传基础及其致病的机制研究首席科学家：夏昆 中南大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：湖南省科技厅 教育部一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题已有的研究显示，孤独症具有高度的临床异质性。由于缺乏明确的疾病相关生化、病理、影像学等指标，孤独症的诊断均以行为障碍为依据。目前国际上孤独症诊断评价的最佳工具被认为是ADOS和 ADI-R，但在国内并未被推广。孤独症的病因至今不明。流行病学调查显示孤独症的遗传度高达90%。近年来，通过染色体核型分析、连锁分析、GWAS、全基因组CNVs研究，已鉴定了多个相关的位点和易感基因，但由于孤独症高度的表型和遗传异
2、质性，这些位点或基因很少能够被重复验证。此外，即使是已经发现的遗传变异，也只能解释10-20%的患者。环境因素也被认为是孤独症的主要病因之一，但由于缺乏系统的调查与研究，至今尚未发现确切的与孤独症发生有关的环境因素。最近几年，关于孤独症的神经生物学机制研究取得了一些重要的进展，对多个孤独症高度相关基因的功能研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路的异常可能是孤独症发生的重要分子机制。但总体而言，关于孤独症的分子致病机制研究还处于早期阶段，易感基因究竟通过什么机制参与疾病的发生、发展，其中所包含的调控机制是什么仍然是当前孤独症研究的重大问题。根据目前的研究现状，我们提出2个需要解
3、决的科学问题：1、孤独症的遗传学基础：已有的研究显示，孤独症的易感位点或基因很难被重复验证。我们认为其根本原因在于孤独症具有高度的临床异质性，同时缺乏有效的疾病相关生化、病理、影像学等特征及临床内表型和亚型分类，导致孤独症易感基因研究中入组样本实际存在较大的不同质性。此外，多数研究以ASD、而不是典型的孤独症患者为研究对象，进一步导致了研究样本的不同质性。而决定其不同质性的主要原因是由于孤独症的遗传基础较非常复杂，染色体异常、CNVs、罕见基因变异、GWAS发现的常见变异等均与孤独症有关。尽管近年来孤独症的遗传基础研究取得了很大的进展，但将所有已发现的遗传因素合并起来，也仅能解释10-20%的
4、孤独症患者。因此，进一步鉴定孤独症的易感基因、确定不同类型变异在疾病发生中的贡献度仍然是阐明孤独症遗传学基础的重要问题。通过鉴定孤独症临床内表型，进行临床亚型分类，并在此基础上鉴定易感基因是解决这一问题的关键。2、孤独症的神经生物学机制：已有研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能以及神经环路的异常似乎是导致孤独症发生的重要原因。然而，现有的研究尚未阐明孤独症发生、发展过程中神经元的生物学特征和功能、以及神经环路等的改变及相关调控机制。在疾病发生中，除了已知的少数通路之外，还有哪些分子、通过什么信号途径、生物学通路和调控机制来参与疾病的病理过程尚属未知。此外，由于遗传基础复杂，至今没有一
5、个合适的孤独症动物模型，从而制约了疾病的发病机理研究进程。因此，在准确鉴定孤独症易感基因的基础上，选择合适的模型和策略开展神经生物学研究是阐明其发病机理的关键。（二）主要研究内容根据孤独症的研究现状及拟解决的科学问题，我们提出如下科学假说：孤独症具有明显的遗传易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以SNPs等常见变异为代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常、新发CNVs和罕见基因突变等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础，并且在环境因素以及表观遗传异常的作用下造成神经发育、神经元可塑性、突触连接功能和神经环路异常，最终导致孤独症表型的出现。图1 研究假说示意图具体研究内
6、容包括以下四个方面： 1、鉴定孤独症的临床表型和内表型：由于尚未发现特定的孤独症病理学特征，目前的诊断仅依赖ADOS，ADI-R等行为学量表，与其他神经精神疾病不同的是，孤独症高度的表型异质性加大了临床诊断的难度。本项目将充分发挥项目组孤独症临床实践和临床基础研究国内领先的优势，在建立孤独症临床和遗传资源库的基础上，详细鉴定孤独症的临床特征，特別注重孤独症患儿的社交障碍、语言障碍、刻板行为等核心症状，并利用生化、电生理、脑成像等技术发现潜在的内表型，建立孤独症核心症状等表型和内表型数据库，为诊断提供客观指标，为孤独症的病因学研究、特别是基于特征表型的样本入组提供科学支撑。2、孤独症的遗传学基础
7、研究：过去近十年的遗传学研究已鉴定了数十个孤独症易感位点或基因，并在某些基因中发现了高致病效应的罕见突变。孤独症的遗传度在90%以上，但已发现的遗传因素只能够解释10-20%的患者，因此孤独症的遗传基础在很大程度上还没有阐明。而且由于孤独症高度的表型异质性，针对某种临床亚型或内表型的遗传基础也很少有人探究。本项目将利用全基因组关联研究寻找孤独症的常见变异，通过全基因组CNVs扫描以及外显子捕获结合第二代测序技术寻找孤独症的罕见致病变异。在临床实践和研究工作的基础上，依据核心症状等临床亚型或内表型进行分组，开展基于临床亚型或内表型的GWAS及第二代测序研究，鉴定孤独症易感基因。3、孤独症的分子发
8、病机制研究：由于遗传基础不明，缺乏合适的细胞和动物模型，孤独症的分子病理机制研究还处于早期阶段。本项目将利用遗传学、细胞生物学、生物化学与分子生物学以及电生理等方法，对前期研究工作已发现的和本项目新发现的部分易感基因开展研究，鉴定孤独症的神经生物学基础。同时，一方面建立患者来源的iPSCs并诱导分化为神经元作为细胞模型，另一方面选择几个高度相关的易感基因构建敲除、点突变敲入或过表达小鼠和果蝇模型，确定这些细胞和动物模型中神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路或行为学变化，预测相关基因在神经发育、突触功能和神经环路中的作用，以阐明孤独症的分子发病机制。此外，由于孤独症多基因遗传背景，单个
9、基因变异可能无法构建符合孤独症行为学特征的动物模型，本项目拟利用最新的染色体工程技术，以发现的疾病相关CNVs为目标，探索构建孤独症的小鼠模型。4、孤独症的分子调控网络和风险预测模型的构建：孤独症的临床和遗传异质性说明多种病因（遗传、环境、表观遗传等）、多条生物学通路参与了疾病发生过程，从系统水平研究孤独症的发病机制将是一个有效的方式。本项目将利用生物信息学技术构建一个数据整合平台，将各个课题组的研究结果以及公共数据，包括环境数据、表型数据、影像学数据、基因组数据以及神经生物学数据等进行整合，并利用数学建模的理论和方法，构建孤独症分子调控网络，寻找潜在的生物学通路，结合转化医学建立孤独症风险预
10、测模型，辅助孤独症的早期诊断和预防。二、预期目标（一）总体目标通过临床实践和研究，发现部分孤独症的特征表型和内表型，对孤独症进行亚型分类，为制定符合国际标准，并具有神经电生理、影像学等特征的诊断体系提供科学数据；利用细胞遗传学、分子遗传学和基因组学技术，鉴定孤独症的易感基因，阐明疾病发生、发展的遗传学基础；利用生物化学、细胞生物学、分子生物学、电生理等技术，以及合适的细胞和动物模型，研究孤独症的神经生物学基础，阐明孤独症的分子发病机制；利用染色体工程技术，探索构建多基因遗传背景、符合孤独症行为学特征的动物模型，并应用于孤独症的发病机制和干预研究；利用生物信息学技术和数学建模方法，整合孤独症有关
11、的临床、遗传、神经生物学等信息，构建孤独症分子调控网络，建立孤独症风险预测模型，为孤独症的早期诊断、早期干预和临床治疗提供科学依据。（二）五年预期目标1. 建立一个10,000例样本以上的孤独症临床和遗传资源库，将孤独症样本以社交障碍、语言障碍、刻板行为等核心症状为主细分临床亚型，并通过生化、电生理、脑成像等方法鉴定几个孤独症的内表型。2. 联合应用经典细胞遗传学、全基因组CNVs分析、GWAS以及第二代测序技术，发现10-20个孤独症（或某些核心症状）的致病或易感基因。3. 选择若干已有的和本项目新发现的与疾病相关的易感基因，研究其生理功能及其参与的神经生物学过程，初步阐明孤独症的分子致病机
12、制。4. 建立10-20个孤独症患者特异性iPSCs细胞模型并分化为神经元，在孤独症患者遗传背景下研究发病机理，建立5-10个孤独症易感基因突变的动物模型研究孤独症易感基因功能。5. 利用生物信息学技术整合大量样本的临床数据、影像学数据、基因组数据等，寻找孤独症相关的生化通路和调控网络并构建一套孤独症网络分析预测模型。6. 在国际权威杂志上发表50篇以上的 SCI 专业论文，其中 IF10 的专业论文8-10篇、IF20 的专业论文3-5篇。7. 培养一支创新团队和中青年学术带头人队伍，确定我国在孤独症病因和发病机制研究领域前沿的学术地位。8. 促进国内外孤独症研究的学术合作和研究资源的交流，
13、以加强我国儿童发育性疾病的基础和临床研究。（三）项目总体目标和五年目标的关系项目总体目标是针对目前孤独症面临的现状，通过临床实践和研究，实现对孤独症的早期诊断、早期干预。在本项目中，经过五年的努力，我们将发现部分孤独症的特征表型和内表型，对孤独症进行亚型分类，为制定符合国际标准的诊断体系提供科学数据；发现孤独症的部分遗传基础；阐明孤独症的部分分子发病机制；构建动物模型，应用于孤独症的干预研究；构建孤独症分子调控网络，建立孤独症风险预测模型。五年目标是实现总体目标的基础，一方面可望鉴定孤独症的主要遗传学基础，初步阐明疾病发生的遗传学机制和分子病理机制，从而为全面认识其发病机理研究提供思路，为后续
14、开展干预和治疗研究提供有效的细胞和动物模型；另一方面，获得的数据及构建的分子网络将为实现孤独症的早期诊断和早期干预提供重要的科学思路和依据。三、研究方案（一）学术思路和技术途径通过临床特征表型、电生理和脑影像学研究等鉴定孤独症内表型，进行亚型分类；在内表型和临床亚型分类及前期研究工作的基础上，利用细胞遗传学、分子遗传学、基因组学及第二代测序技术，鉴定孤独症的易感基因，阐明疾病发生、发展的遗传学基础；以培养神经元、患者来源的iPSCs诱导神经元及易感基因动物模型，综合利用生物化学、细胞生物学、分子生物学、电生理、行为学等技术，研究孤独症的神经生物学基础，阐明其分子发病机制；采用染色体工程技术，构
15、建多基因遗传背景的孤独症动物模型；整合孤独症有关的临床、遗传、神经生物学等信息，构建孤独症分子调控网络及风险预测模型，为孤独症的早期诊断、早期干预和临床治疗提供科学依据。图2 总体技术途径 （二）创新点与特色1. 临床与基础的结合：国际上孤独症研究的样本多为ASD患者，具有高度临床异质性，给基础研究工作带来很大困难。鉴定孤独症不同临床亚型的分类，消除样本表型异质性给基础研究工作，尤其是给遗传学研究带来的影响极其重要。本项目设置了一个有较强临床研究基础的课题组，通过临床表型、影像学等技术对遗传资源进行详细的临床亚型及内表型分类，进一步以特异的内表型对样本分组，由于分组患者有较高的同质性，有利于鉴
16、定在孤独症发生中起重要生物学意义的易感基因。2. 学术理论的创新：本项目中我们提出的科学假说是“孤独症具有明显的遗传易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以SNPs等常见变异为代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常，新发CNVs和罕见基因突变等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础，并且在环境因素以及表观遗传异常的作用下造成神经发育，神经元可塑性，突出连接功能和神经环路异常，最终导致孤独症表型的出现”。此假说是根据目前孤独症的研究现状提出的，具体依据包括：（1）已鉴定的易感位点或基因众多，但很少被重复验证；（2）近年的研究发现孤独症患者约3%携带染色体异常，约5%存在相关CNVs，提示在异常染色体和CNVs累及的区间存在与孤独症直接相关的易感基因；（3）罕见变异导致子代患病，但携带相同变异的父亲或母亲正常；（4）所有易感位点或基
