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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果山西产苦参种子生物碱类化学成分分析及其资源化价值探讨苦参Sophora flavescens Ait.为豆科槐属多年生草本或亚灌木状植物，常生于海拔100 m以下的山坡、沙地草坡灌木林中或田野附近，主要分布于我国南北各省区，以及印度、日本、朝鲜、俄罗斯西伯利亚等地。近年来，我国山西长治、河南西部、山东西南部、陕西中南部，以及安徽、湖北、贵州等地开展苦参人工种植及半野生抚育，形成了苦参资源面积不断扩大，苦参药材产量供过于求的现实状态。由此也产生了大量的花和果实，其
2、资源利用价值如何，是药农、生产企业和政府关注的经济民生和社会问题。现代研究表明1-4，苦参植物根中主要的功效物质为其喹喏里西啶型生物碱类化学成分。该类资源性化学成分具有抗肿瘤、抗乙肝病毒、抗炎、抑菌杀虫等生物活性，常用于清热燥湿、杀虫、利尿等临床配方调剂和中药制剂产品的生产，以及生物农药、兽药等产品的开发5-6。目前该类化学物质资源的获取途径主要是从同属植物苦豆子S. alopecuroides L.种子中获得。依据中药资源化学的研究思路和启示7-8，提出了苦参种子是否可替代苦豆子作为苦参素等喹喏里西啶型生物碱资源性化学成分原料的科学问题。基于此，在前期研究工作的基础上，以我国目前拥有约20万
3、亩的山西振东制药集团建立的长治苦参人工种植和半野生抚育基地生产的苦参种子为研究对象，分别采用UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-TQ-MS技术分析苦参成熟种子中生物碱类资源性化学成分的组成及其含量，并与同属近缘植物苦豆子成熟种子进行比较，以探讨其开发利用价值和资源化利用策略，最终为苦参非药用部位的资源化利用提供科学依据。1 材料药材的采集：苦参成熟种子样品于XX年10月采自山西长治苦参GAP种植基地，苦豆子成熟种子样品于XX年10月采自宁夏盐池，经南京中医药大学段金廒教授鉴定分别为豆科槐属植物苦参S. flavescens及苦豆子S. alopecuroides的成熟种子。标本存放于南京中医
4、药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心。Waters ACQUITY UPLC系统；Waters Xevo TQ 质谱仪、Waters Q-TOF Premier飞行时间质谱仪；质谱工作站软件；BT125型电子天平；Milli-Q Advantage超纯水系统；KQ-250E型超声波清洗器；Beckman Coulter Microfuge 16型离心机。化学对照品苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、槐胺碱、金雀花碱、N-甲基金雀花碱购自合肥博美生物科技有限公司。其纯度经HPLC 检测均大于98%。乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；去离子水为Milli-Q Advantage超纯
5、水系统自制；其他化学试剂均为分析纯，购自上海国药化学试剂公司。方法与结果 对照品溶液的配制精密称取对照品金雀花碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、槐胺碱、苦参碱、槐果碱适量，加甲醇制成混合对照品贮备液。取一定体积的上述贮备液加甲醇稀释后，制成不同浓度的对照品溶液，用以线性关系考察，其质量浓度分别为， ，L-1。对照品溶液在注入液相色谱仪前经m 的微孔滤膜滤过。所有对照品溶液均在条件下贮藏。2.供试品溶液的制备14取 样品粉末，精密称定，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，称重，静置1 h 后，室温下超声提取60 min，称重，加75%乙醇补足失重，摇匀，1000 rm
6、in-1离心10 min，取上清液，加75%乙醇稀释10倍，混匀后经m 的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.生物碱类化学成分定性分析 UPLC-Q-TOF-MS/MS条件色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，以A和B流动相，梯度洗脱：0min，5%8% B；730 min，8%30% B；303min，30%5% B；流速min-1；柱温30 ；进样体积L。质谱条件正离子模式，毛细管电压 kV，离子源温度120 ，去溶剂化温度350 ，流速600 Lh-1，锥孔气流速50 Lh-1。检测离子范围m/z 1001 000。样品分析苦参干燥种子及苦豆子干燥种子样品总
7、离子流图见图1。其中，苦参种子样品中共检测出20个色谱峰，苦豆子种子样品中共检测出21个色谱峰。经色谱峰保留时间及质谱信息比对发现，苦参种子与苦豆子种子中共有18个共有色谱峰。通过与对照品比对及参考文献，共指认出14个生物碱类化学成分，其中苦参碱型9个，金雀花碱型2个，臭豆碱型3个。其具体信息见表1，化合物结构见图2。2.金雀花碱；3.氧化苦参碱；4.氧化槐果碱；7. N-甲基金雀花碱；10.槐定碱；20.苦参碱；21.槐果碱；A.混合对照品溶液；B.苦参成熟干燥种子；C.苦豆子成熟干燥种子。2.生物碱类化学成分定量分析 UPLC-TQ-MS/MS条件14色谱条件：采用ACQUITY UPLC
8、 BEH C18色谱柱，以A和B流动相，梯度洗脱：0min，5%10% B；4min，10%20% B；5min，20%20% B；911 min，20%25% B；流速min-1；柱温30 ；进样体积L。质谱条件：离子化模式ESI+；检测方式多反应检测；毛细管电压 kV；离子源温度150 ；脱溶剂气温度550 ；脱溶剂气流量1 000 Lh-1；锥孔气流量50 Lh-1；碰撞气流量min-1；取样锥孔电压及碰撞能量见表2。方法学考察 线性关系、检测限和定量限试验 取混合对照品贮备液，分别稀释成系列浓度的对照品溶液，按项下色谱质谱条件依法测定，以峰面积为纵坐标Y，对照品溶液浓度为横坐标X，进行
9、线性回归分析，计算相关系数；检测限和定量限分别在信号对噪音比值为3和10时测定。所测定的7个化学成分线性关系良好，且灵敏可靠，结果见表3。精密度、重复性和稳定性试验 精密度试验：取对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次以测定各待测成分的峰面积，以各峰面积的相对标准偏差来评价其精密度。结果显示各成分的峰面积RSD均小于%，表明该方法精密度良好。重复性试验：按照上述供试品溶液制备方法，取同一样品制备供试品溶液，经UPLC-TQ-MS/MS分析，计算其含量及RSD。结果各待测成分含量的RSD均小于%，表明该方法重复性良好。稳定性试验：取重复性试验中的一份供试品溶液，分别于0， 12，4，h时注入液
10、相色谱仪，计算各成分峰面积，结果显示各成分峰面积RSD均小于%，表明供试品溶液在4h内稳定性良好。回收率试验 取已知含量的苦参种子样品，分别按已知含量的80%，100%，120%个水平加入对照品，按项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并注入液相色谱仪在项下方法测定，计算平均回收率，见表4，显示各成分平均回收率介于%，RSD均小于%，表明本方法准确性较好。样品分析取苦参成熟干燥种子及苦豆子成熟干燥种子样品，按项下方法分别制备供试品溶液，按项下分析条件进样分析，测定金雀花碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、槐胺碱、苦参碱、槐果碱的含量，结果显示，苦参成熟干燥种子中7种生物碱的总量为g-1，苦豆子
11、成熟干燥种子中生物碱总量为g-1。在7种生物碱中，氧化苦参碱在苦参种子中的含量较高，达到g-1，约为苦豆子种子中含量的倍， 结果见表5。讨论近年来，苦豆子种子中含有的喹喏里西啶型生物碱类资源性物质因具有的广泛生物活性，已被成功开发为抗乙肝病毒、抗肿瘤药物，功能性洗消用品，生物农药等资源性产品。目前市场上已有苦参素注射液、盐酸槐定碱注射液、苦参素胶囊等资源性产品上市。苦豆子为沙生荒漠植物，具有重要的防风固沙和生态屏障作用，近些年的大量开发利用使其资源存量急剧下降，对西北地区脆弱的生态环境带来了严重的影响。因此，如能从槐属近缘植物类群中发现可替代资源，将会起到重要的资源补偿和保护作用，又能满足国内
12、外医药工业对此类具有重要价值资源性物质的需求。本研究以采自山西长治苦参种植基地的苦参成熟种子为研究对象，同时与苦参同属近缘资源性植物苦豆子的种子进行比较，结果显示苦参种子中的生物碱化学成分组成种类及含量与苦豆子种子总体呈高度相似性，且其氧化苦参碱含量约为苦豆子种子的倍；槐胺碱含量约为苦豆子种子的2倍。本研究结果提示可将苦参种子作为获取苦豆子生物碱类资源性化学成分的新资源。对其加以资源化利用与产业化开发，达到资源节约、创新资源价值和保护环境的目的，将对苦参植物资源的循环利用和产业经济发展起到积极的推动作用15。此外，据报道苦参种子中尚含有丰富的、结构独特，且具有一定降血糖、调血脂及雌激素样作用的多糖、寡糖及糖肽类资源性物质，如具有降血糖作用的半乳糖甘露聚糖类等16-17。因此，基于循环经济发展理念，可对苦参种子各类资源性化学成分进行精细化利用，以创新苦参资源价值，提升苦参资源的利用效率。课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。
