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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果大肠杆菌变种EspA的研究进展 【关键词】 大肠杆菌O157：H7；基因，EspA 大肠杆菌是最常见的微生物之一，在 自然 界广泛分布，在动物体内也存在。它具有易培养、生长快、易变异等特点。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic ，EHEC)是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国家暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎( hemorrhagic colitis，HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HU
2、S)、血栓形成的血小板减少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura ， TTP) 并发症，严重威胁着人类的生命健康1。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。198年，美国首次从出血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌，并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌O15: H可作为一种病原菌使人类致病，但此时并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠杆菌O15:H引起的感染在美国、加拿大、英国和日本等发达国家迅速增加,逐渐引起广泛重视。我国于198年由权太叔等首次从出血性结肠炎患者粪便中分离到O15:H大肠杆菌。此后，福建、
3、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省陆续分离出该菌。 目前 美国、英国、加拿大等国家又出现了新的耐药性变种2，3，导致了多人死亡。因此大肠杆菌致病变种引起了国内外学者的密切关注，并对大肠杆菌变种进行了深入的 研究 。现仅以EHEC血清型O157：H7为例，对它致病因子型分泌蛋白即EspA( Esp 为E. coli secreted protEin 缩写) 进行综述，为对该菌引起的疾病进行预防、诊断和 治疗 提供有力的依据和 参考 。 1 EspA的研究意义 目前，对O15:H感染尚缺乏有效的防治 方法 ，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗，但研究证明抗菌药物可促使O15: H7大肠杆菌释放Vero
4、毒素，从而使患者并发HUS的危险性增加。发病机理主要通过细菌对上皮细胞粘附和产生毒素两个过程。粘附是细菌感染的第一步。当EHEC 侵入机体肠腔后，借助菌毛局限性地粘附在盲肠和结肠上皮细胞的刷状缘上并损害微绒毛，同时紧密地结合在肠上皮细胞膜的顶端。型EspA在细菌的粘附定植中起到关键作用。EspA 形成纤丝样管状结构，在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁，把效应蛋白转移至宿主细胞表面，对细菌粘附至宿主内皮细胞具有关键性启动作用，并且EspA 具有良好的免疫原性及免疫反应性，可以作为候选免疫原，用于O15的疫苗研制，在消除定植带来的A/E(attaching/ effacing) 损伤，缩短感染周期具
5、有较大的 应用 价值。 EspA 的基因与分子结构 编码EspA 的基因主要存在于染色体上大小为35kb的被称LEE(locus of enterocyte effacement)的毒力岛上4，LEE包括40 多个开放阅读框(ORFs)，至少5个操纵子，编码EspA 的主要是LEEEspA 共578bp，表达的蛋白约为25Kda。EHEC 的型分泌系统( type secretion system,TTSS) 是特异的，但与细胞壁相连的针状复合体却是保守的。此复合体是由EspA 构成的纤丝伸展成的针状物5,6。它的三维结构由5根EspA 纤丝螺旋向前延伸，形成外径为12nm、内径为 的四周密闭
6、的中空螺旋管，外表面布满了螺距为的线性螺旋构成的脊和槽，脊弯曲成扇形样，是EspA 亚单位的特征。与外面相比较，中央的通道是平滑的6。EspA 纤丝样针状物的长度可由细菌内EspA 亚单位的数量调节7。有直接证据证明EspB、EspD 效应蛋白是从此管道内被转入到宿主细胞膜上，并形成35nm 的小孔，而其它效应蛋白(Tir，EspF，Map，Esp G,EspH，Cif，和Esp I/NleA)沿通道及小孔更容易进入宿主细胞711。 EspA 表达的调节 EspA 的表达是转录后调控的，需要有合适的环境条件先引起LEE12表达，接着受到EspA、EspB、EspD mRNA 转录翻译的进一步调
7、控。从牛体内分离出两株野生型O15:H，一株为EspD 高表达，一株为低表达，先在M9培养基中培养，然后转入MEM-HEPES 中培养，EspD 高表达株细菌的EspA 表达阳性率为70%95%，而低表达仅为30%。Esp 表达具有培养基依赖性，在M9基本培养基中不能表达，而MEM2HEPES 改良培养基则能促进纤丝样EspA 的表达及效应蛋白的分泌。碳酸氢根离子加入到Luria 肉汤中可以刺激效应蛋白的分泌12。toxB 基因与ToxB大质粒上的toxB 基因编码一362kD 的蛋白ToxB，对ToxB的氨基酸序列与许多粘附因子有同源性，能促进型分泌系统分泌粘附因子。将EHEC O15Sak
8、ai 菌株中的pO15去除而构建O157Cu(O15cured of pO15) 后发现：缺失pO157的O15Sakai对宿主细胞的粘附能力下降；将携带toxB 基因的mini2pO15(pIC137)导入O157Cu 后可增强其粘附力；携带pIC13的O157Cu可刺激EspA、EspB 和Tir的产生及分泌。目前认为ToxB 影响 型分泌系统分泌蛋白质是在转录后水平上发生的13。EspA 的表达具有时效性。在整个对数生长期表达在较高水平，而到了静止期后则迅速下降。另外，一旦EspA 完成效应蛋白EspB ，D 及Tir 的转运，为了intimin 与受体Tir更好地结合以便细菌更紧密地粘
9、附到宿主细胞，EspA 会从细菌表面上脱落，表达也会降低14。 EspA 在粘附损伤中的作用 EspA 以多聚体形式存在，形成纤维样管状结构，连接到宿主细胞表面，EspB、EspD 经过此通道分泌到宿主细胞，并在细胞膜表面形成小孔。Fivaz 和Vander15发现此EspA、EspB、EspD 蛋白组成了一个分子注射器(molecular syringe)的结构，EspB 和EspD就像注射器的尖部(tip of molecular syringe)，可以在宿主细胞膜上形成孔道，然后将Tir注入到宿主细胞膜上。intimin与Tir结合后可引起宿主细胞信号转导反应并导致细胞骨架重排而形成特异
10、性损害5，16，17。实验证明EspA 介导细菌对宿主细胞的粘附。将EspA突变株灌入SPF 级ICR 封闭群小鼠体内，检测粪便排菌情况，4日后灌入突变株组无一只小鼠检测出细菌，而野生株则2天还能检测到只小鼠中的只有细菌排出，通过电镜和免疫荧光技术观察粘附改变，发现EspA 突变株粘附明显减少。体外细胞粘附实验也证明对Hela 细胞的粘附被减弱18。Robert K. Shaw 和Sarah Daniell等17利用扫描 电子 显微镜(SEM) 和透射电子显微镜( TEM) 观察到EspA 在红细胞粘附中的作用。EspA 缺失突变株与红细胞(RBC) 混合培养，发现RBC 不被破坏，而野生株则
11、出现严重溶血，证实了EspA 在溶血中起到重要作用。 O15EspA 的免疫学性质 .1 EspA 交叉反应性 型EspA广泛存在于致病性G-杆菌中，在非致病菌肠杆菌中未见表达。对O15:H的分子进化研究发现EPEC 和EHEC 的L EE 高度同源4。Biance C. Neves 等19研究了EPEC 十种不同血清型的EspA分子特征和超微结构，在全部血清型中，EspA 多肽序列至少有65%的一致性。其中对O127:H6和O55:H6两种血清型比较 分析 发现，两者的EspA 多肽序列完全一致；而O111:H2和O128:H2也至少有95%的一致性。Marita Noguerabenza
12、等20调查了北美的墨西哥市和弗吉尼亚州诺福克市12名妇女乳液，发现有90%以上存在EspA 抗体。因为EspA 比其它毒力分子更加保守，来源不同的多型病原体的EspA 变异体具有结构相似性，抗EspA抗体有高发生率及广泛的交叉反应，因此EspA抗体提供了对多种血清型广泛交叉的保证作用。通过序列分析显示O127:H6和O157:H7的EspA具有85%相同，EspA抗体能够阻止EPEC和EHEC许多血清型的粘附，不像抗LPS或intimin抗体仅对有限的肠道病原体有保护作用。并且EspA是表面表达和多聚体形式存在，具有良好的免疫原性，抗EspA 抗体常比其它表面蛋白的抗体存在的数量为多；EspA
13、 的天然暴露可诱导良好的免疫反应且持续时间长，这些因素使它可能成为研制抗EHEC 和EPEC 多种血清型疫苗的有力的候选者。以此设计的疫苗相对于O15LPS 能够提供广泛的交叉保护作用21。但也有报道，EPEC E2348/69和EHEC5-170的EspA抗体不具有交叉反应性，尽管它们之间基因同源性较高。EHEC O157:H7的EspA可以显著减少家畜的感染，但不能保护其它血清型的感染。如EHEC O26:H11，EHEC O103:H2和EHEC O1115。因此研制融合重组的EspA 疫苗是非常必要的。 .2 EspA免疫原性及免疫保护性 EPEC 和EHEC 的EspA 对人和动物都
14、有免疫原性22。用EspA 重组蛋白成功诱导兔的免疫应答，噬菌体呈现技术显示有相应抗体产生。用传统的噬菌体抗体洗脱和菌落过滤器筛选的方法筛选出抗体库，得到EspA特异性抗体。识别E. coli O15的EspA 抗体也能识别来源于eae 基因突变缺失的O157DM3株和O111株的EspA分泌蛋白22。用EspA重组蛋白加VSA2佐剂皮下接种已感染O15:H的牛体内，发现抗EspA 抗体滴度比对照组增加1倍，细菌的粪便排泄显示减少23。D. Karpman 等24用免疫印迹的方法研究了EspA 重组蛋白的血清免疫应答反应，并检测了感染O157:H7后的病人血清中EspA、EspB的抗体，包括三
15、者的IgG，及EspA和EspB的IgA、IgM，结果显示具有较高的特异性和敏感性。Yuling li 和Elizabeth Frey 等25观察了人对O157:H7的EspA的免疫应答，方法是用免疫印迹及ELISA 技术检测感染过O157:H7人血清对纯化的EspA重组蛋白的免疫反应，结果显示感染8天后的病人血清对EspA有强烈反应，说明人感染O157:H7后产生了EspA抗体，揭示EspA 可作为研制预防EHEC感染疫苗的候选抗原分子。 结语 EHEC O157:H7感染尚缺乏有效的治疗手段，研制预防EHEC O157:H7感染的疫苗成为可行而有效的办法。细菌粘附是感染的第一步，如果能阻止细菌的粘附，不仅可以阻止细菌的感染，还能有效地预防O157感染开始时粘附所造成的A/E损伤。EspA是O157引起的A/E 损伤的关键分子，具有良好的免疫性和交叉保护性，是研制O157疫苗的重要候选抗原。根据EspA 结构及表达的特点，在进行O15研究与疫苗研制过程中需注意以下两点：EspA 分泌表达的时效性。因为EspA具有菌株依赖性和生长周期的依赖性，并且在完成效应蛋白的转移后即脱落或消失，所以要控制好条件以保证细菌EspA 的分泌表达。如何保证天然的构象。EspA 是一个多聚体，结构较为复杂，天然构象的改变可能影响其活性及免疫特性。 【 参考 文献 】 1Li Y, Fr
