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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果多重耐药临床菌株中整合子结构的检测与分析 【关键词】 ,整合子；,整合酶；,细菌耐药；,临床分离株 摘要： 目的 研究 广州暨南大学附属第一 医院004年部分临床菌株样本的整合子及其基因盒的分布特性。 方法 多重PCR检测与细菌耐药关系密切的1、2、3类整合酶基因，进一步对阳性样本可变区的基因盒序列鉴定 分析 。结果 随机抽取109株临床菌株，整合酶阳性检出率为972%(106/109)，其中1类整合酶阳性菌100株(917%)，2类整合酶阳性菌1株(092%)
2、，此外有5株(46%)同时检出1、2类整合酶，没有检测到3类整合酶；基因盒鉴定结果显示，插入基因盒以dfrA(甲氧苄氨嘧啶耐药相关)和aadA(氨基糖苷类耐药相关)基因家族为主，也在少数菌株中发现了aacA4、cmlA1、catB3以及sat1基因盒。其中又以dfrA12、orfF和aadA2组合最为常见，耐药基因盒PCR扩增片段为1913bp(646%)；此外，还发现了同时存在两种整合子结构的菌株。结论 整合子普遍存在于临床菌株中，可通过基因水平转移在不同菌属间传播，提示各医药单位必须加强耐药监测及合理选择抗菌药物，以减少多重耐药细菌的发生和 发展 。 关键词： 整合子； 整合酶； 细菌耐药
3、； 临床分离株 Detection and characterization of integron structurein clinical bacteria isolates ABSTRACT Objective To investigate the distribution, characterization and relativity between multiresistance and integrons. Methods In this study, the presence and genetic content of classes integrons among 10cl
4、inical strains were examined by multiple PCR and sequencing. Restricted enzymefragment length polymorphisms (RFLP) was also used for the homology of the gene cassettes. Results intI1 was detected in17% of the isolates; intIwas detected in 1 (092%) isolates, both intI1 and intIwere detected in other
5、(46%) isolates and no intIwas detected. Twelve different genes, including 10 genes respondible for antibiotic resistance and unknown genes, were detected. The genes most commonly found in integrons were those for aminoglycoside (aadA) and trimethoprim (dfr) resistance. Bacteria contain more than one
6、 integron were also found in this study. Conclusion Resistance mediated by integron was extensively existed in clinical isolates of both Gramnegative and Grampositive bacteria. It seems that the integrons are more widely existed than we expected. It implied the necessary for survEillance horizontal
7、transference of antibiotic resistance gene(s) among bacteria genus. KEY WORDS Integron; Integrase; Antibiotic resistance of bacteria; Clinical isolates 抗生素的发现与 应用 ，使人类成功治愈了许多感染性疾病，是人类医疗发展史的里程碑。然而，随着抗生素的广泛使用(包括医疗、畜牧、养殖业)及不恰当使用，细菌耐药性 问题 正日趋严重。微生物群落特别是病源微生物，面临强大的抗生素选择压力，演化出许多不同的耐药机制。已有报道，耐药基因可通过各种基因元件的
8、水平转移在微生物群落间传播，包括质粒、转座子和噬菌体等可自主转移的元件都可以作为耐药基因传播的载体1。 目前 已经证实整合子元件能介导耐药基因在不同菌群间有效的传播2。整合子为 自然 界存在的具有捕获、整合以及表达基因盒能力的基因表达系统。典型的整合子结构包括了5端保守序列(5CS)和3端保守序列(3CS)以及中间的可变区，整合酶基因(intI)、启动子及整合位点(attI)位于5CS，基因盒整合于attI下游；3CS则因整合子类型不同而异。基因盒通常不含有启动子，其表达依赖位于整合子5保守区域的启动子，在启动子的作用下耐药基因得以表达2。目前已发现的整合子结构中，第1、2和3类整合子的研究最
9、为普遍和详细，并已证实与细菌的耐药性有关3。其中最常见的是第1类整合子，在临床检测中具有重要意义，它可以通过首尾相接的方式整合一个或多个耐药基因盒，形成多重耐药，对人们的健康形成严重威胁4。因此对整合子的分布情况进行监测是十分必要的。一般认为整合子广泛的存在于革兰阴性菌中，并介导其产生耐药性。近来越来越多的研究却表明，整合子在介导革兰阳性菌多重耐药中也起着重要的作用5，6。为此本实验对109株随机临床菌株样本进行整合子分布的检测，并进一步对其携带的基因盒作了分析与鉴定。 1 材料和方法 菌株本实验所用菌株分离自XX年暨南大学附属第一医院住院患者临床标本，共109株。包括各种常见病原菌()，其中
10、革兰阳性菌23株，革兰阴性菌86株。 O1 strain SK 10(Dr. Dalsgaard惠赠)， DH5 携带质粒pR483:Tn7(Dr. Falbo惠赠)， DH5携带质粒pSMB731(Dr. Hall惠赠)分别作为第1、2、3类整合子的阳性对照； C600(山崎伸二教授惠赠)为阴性对照菌。 药敏检测临床标本菌株的药敏检测实验由暨南大学附属第一医院临床检验中心完成，采用纸片扩散法。药敏结果判断参照NCCLS(XX)标准。 DNA模板的制备DNA模板的制备，采用改进的SDSCTAB方法79。 整合子的检测以检测整合酶基因的存在与否为依据，采用多重PCR(multiplex PCR)
11、的方法。根据1、2、3类整合子的整合酶基因(intI)序列分别设计具有相同或相近退火温度的三对引物，并确保获得不同大、小的扩增片段，以便电泳检测鉴定()。设计的引物经Clustal W及Blast分析，确定与GenBank数据库中非目的序列无同源性。所有引物由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR反应体系为50l，含15l DNA模板(约100ng)，02pmol/l 第1类整合酶引物，02pmol/l第2类整合酶引物，1pmol/l第3类整合酶引物，125U Taq DNA聚合酶，25mmol/L dNTP，5l 10PCR缓冲液(宝生物公司)。PCR反应程序为：94预变性5min；94变性3
12、0s，52退火30s；72延伸2min，共30个循环，最后72延伸7min。 基因盒检测与鉴定通过PCR检测整合酶基因，确定细菌携带整合子的情况，并针对第1、2类整合酶阳性菌株进一步以保守序列引物扩增整合子的可变区9，10。耐药基因盒扩增反应体系为50l，含15l DNA模板(约100ng)，06pmol/l引物，125U Taq DNA聚合酶，25mmol/L dNTP，5l 10PCR缓冲液(宝生物公司)。循环参数同上，在进行第2类整合子可变区扩增时将退火温度升高到55。PCR产物均由琼脂糖凝胶电泳检测，EB溶液染色，BIORAD Gel Doc EQ凝胶成像系统进行结果分析。 可变区扩增
13、产物序列分析不同的扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGMT载体，转化到 DH5中，-20冻藏，以供测序及后续研究使用。测序工作由上海博亚生物技术有限公司完成，测序结果经Blastn检索GenBank 数据库( )，获得同源信息，分析其可能的功能。对片段大、小相同的扩增产物选择合适的限制性内切酶，进行多态性分析，酶切反应体系20l，包括：PCR产物8l，酶缓冲液2l，内切酶1l，无菌去离子水定容至20l。37恒温反应1h，加入3l 10LoadingBuffer终止反应，3%琼脂糖凝胶电泳检测。分子量大、小和酶切图谱均相同的扩增子被认为是相同的。 2 结果 .1 药敏结果试验菌株对常用的18种抗生
14、素做药敏检测，结果显示所有菌株均表现为3种以上的耐药性，近40%的菌株甚至对9种以上的抗生素耐受。最常见的耐药表型包括：氨苄西林耐药(846%)，萘啶酸耐药(802%)，壮观霉素耐药(820%)，链霉素耐药(811%)，磺胺甲基异口恶唑/甲氧苄氨嘧啶耐药(803%)等。 .2 整合子检测结果109株临床菌株中106株(972%)检测到整合酶基因(intI)存在，其中100株(917%)仅检测到1类整合酶，1株(09%)只存在2类整合酶基因，另有5株(46%)在检测中发现同时含有1、2类整合酶，没有发现第3类整合子()。检测结果显示整合子可普遍存在于不同菌属中，包括革兰阴性菌和革兰阳性菌。在对整
15、合子阳性菌可变区基因盒扩增中，共获得9条不同大、小的片段，构成13种不同的电泳图谱()；同时，也获得了10株(92%)可变区扩增阴性样本，出现这一现象存在两种可能的原因，其一是该整合子缺失了3CS部分序列11；此外该整合子可变区很大，超出了rTaq酶的扩增范围也是原因之一。 .3 可变区基因盒序列分析可变区扩增阳性菌96株，其中对6株含有2类整合子结构的菌株以引物TiF/TiB进行可变区扩增时，均获得唯一的2385bp片段；对1类整合子可变区扩增时，结果表现出更丰富的多样性，51株获得1913bp的扩增产物，9株得到1664bp的片段，9株获得200bp的扩增产物，株获得1009bp的扩增产物，3株得到635bp的片段，2株获得1179bp的扩增产物；还有1株获得2360和2655bp的片段()。将大于500bp的片段送上海博亚生物技术有限公司进行序列的测定。对来自Staphylococcus aureus GH39的约20kb片段进行序列检测，分析结果表明该片段序列全长1913bp，含有三个开放阅读框ORF(dfrA12、orfF和aadA2)，其中dfrA12和aadA2分别与甲氧苄氨嘧啶和氨基糖苷类抗生素耐药相关，orfF为未知功能ORF； 同样，对来自Proteus mirabilis GH221的约16kb片段测序， 序列全长1664bp， 含两个ORF(d
