壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究-_1

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果壳寡糖抗肿瘤作用及免疫调节机理的研究* 作者：吴海明，华晓阳，何登全 【摘要】 目的 研究 壳寡糖对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用以及壳寡糖对培养的巨噬细胞相关的细胞因子表达的 影响 。 方法 接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖，观察壳寡糖对肿瘤的生长和抑制作用。用相对定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。 结果 壳寡糖对S180肉瘤的抑瘤率为%，对照组，两组比较， P 。巨

2、噬细胞加入壳寡糖作用24h后，细胞因子的表达明显增强( P )。 结论 壳寡糖具有良好抑制肿瘤生长和转移的作用。壳寡糖可增强巨噬细胞相关的细胞因子表达。 【关键词】 壳寡糖；肿瘤；巨噬细胞；细胞因子 【Abstract】 Objective To study the influence of oligochitosan in inhibiting growth and metastasis of tumor in rats， and in expression of cytokines associated with macrophage. Methods Inhibition of grow

3、th oftumorwas observedafteroligochitosaninjected into rats throughtailvEin，the influence in transcription and translation of cytokines associated with macrophage was measured by RT-PCR and ELISA techniques. Results Inhibition rateof sarcomaS180 was%，controlled after oligochitosan added to macrophage

4、，expression of cytokine increased significantly( P ). Conclusion Oligochitosan can inhibitgrowth and metastasisoftumor，andenhance expression of cytokines associated with macrophage. 【Key words】 oligochitosan； tumor；macrophage；cytokine 甲壳素是 自然 界丰富的生物资源之一，其部分脱乙酰化产物壳聚糖，具有抗肿瘤、免疫调节、抑菌等多种生理功能。但壳聚糖不溶于水，利用纤

5、维素酶将其降解为壳寡糖，具有较好的水溶性易被人体吸收，本实验旨在研究壳寡糖对实验性小鼠S180肿瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及壳寡糖对体外培养的巨噬细胞相关的细胞因子基因表达的影响。 1 材料与方法 材料 壳寡糖 由浙大医学院分子生物学实验室制备。 动物来源 小鼠由浙江大学医学院动物中心提供，体重为1820g。 小鼠单核巨噬细胞 由中科院上海细胞所提供。 标准DNA marker和ELISA实验试剂 由上海贝西 科技 公司提供。 1. 方法 壳寡糖抗肿瘤作用实验方法 无菌取S180肉瘤和Lewis肺癌细胞，制成2107细胞/ml的细胞悬液；皮下注射肿瘤液于ICR种小鼠，次日分组进行实验，每组

6、10只ICR种小鼠。实验组尾静脉注射100mg/kg的壳寡糖，对照组注射生理盐水，停药次日处死小鼠，剥离实体瘤称重或观察转移病灶数， 计算 抑瘤率。 壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响实验方法 培养小鼠采用RT-PCR法和ELISA法研究壳寡糖对巨噬细胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表达的影响：实验组和对照组巨噬细胞分别提取RNA和收集上清液RT-PCR法检测mRNA水平基因表达的变化以及ELISA法检测蛋白表达量的变化。 1. 统计学方法 各组值均采用均数标准差表示，组间采用t检验， P 为统计学差异有显著性意义。 结果 .1 壳寡糖抗肿瘤作用 壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响

7、，从表中可以看出实验组的抑瘤率为%，环磷酰胺组的抑瘤率为%。壳寡糖对Lewis肺癌的影响实验组的转移灶为，对照组的转移灶为， P 。综合表1和表2可以看出壳寡糖对肿瘤的生长和转移具有明显的抑制作用。 表1 壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响 表2 壳寡糖对小鼠Lewis肺癌转移的影响 . 壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响 . 壳寡糖最适作用时间的确定 巨噬细胞贴壁后加入壳寡糖，在4、8、16、24、48h不同时间段通过RT-PCR法检测IL-1、INF-、IL-18的基因转录水平，结果显示24h达到高峰，故确定以24h为壳寡糖最适作用时间。 .2. 壳寡糖最适作用浓度的确定 小鼠巨噬细胞

8、经培养贴壁后，按浓度10、20、30、40、60、80g/ml的剂量加入壳寡糖继续培养，各组巨噬细胞样本经RT-PCR法结果见表3、4、5。 表3 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-1基因转录水平的影响 注：以-actin为内参照标准，各组均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P ( n =4) 表4 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-18基因转录水平的影响 注：以-actin为内参照标准，各组均值以均数标准差表示；表示经t检验与对照组差异有显著性， P ，*表示经t检验与对照组差异有显著性， P ( n =4) 表5 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞TNF-基因转录水平的影响 注：以-

9、actin为内参照标准，各组均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P ( n =4) 结果显示10g/ml的壳寡糖实验组与对照组比较无显著性差异，20、30及40g/ml组均差异有显著性，故确定20g/ml的壳寡糖为对IL-1和TNF-的最适作用浓度，以40g/ml的壳寡糖作为对IL-18的最适作用浓度。 .2.0g/ml的壳寡糖对IL-1和TNF-的转录和翻译水平的 影响 用含20g/ml壳寡糖刺激培养的巨噬细胞，用RT-PCR法检测壳寡糖对IL-1和TNF-转录的水平的影响，用EiSA法检测壳寡糖对IL-1和TNF-分泌的影响。 .2.0g/ml壳寡糖对IL-18基因

10、转录水平和翻译水平的影响 用含40g/ml壳寡糖的细胞培养液培养巨噬细胞，RT-PCR检测对IL-18基因转录水平的影响ELISA法检测对IL-18细胞因子分泌的影响。 表60g/ml壳寡糖对IL-1基因转录水平的影响 注：以-actin为内参照标准，均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P 表70g/ml壳寡糖对巨噬细胞释放IL-1的影响 注：均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性，P 表80g/ml壳寡糖对TNF-基因转录水平的影响 注：以-actin为内参照标准；均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P 表90g/ml壳寡糖对

11、巨噬细胞释放TNF-的影响 注：均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P 表100g/ml壳寡糖对IL-18基因转录水平的影响 注：以-actin为内参照标准，各组均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P 表110g/ml壳寡糖作用下IL-1ELISA检测结果 注：各组均值以均数标准差表示；*表示经t检验与对照组差异有显著性， P 结合RT-PCR和ELISA实验结果，可以看出壳寡糖能促进巨噬细胞细胞因子IL-1、TNF-和IL-1基因表达，促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、TNF-和IL-18。 讨论 国内外 研究 发现壳寡糖具有多种优异的生理功能

12、，能提高机体的抗肿瘤能力和免疫功能13。实验结果表明，以壳六糖为主的壳寡糖具有良好的抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤转移的作用。壳寡糖对S180肉瘤的抑制作用较环磷酰胺略弱，但两者与对照组比较差异均有非常显著性和干扰素组，两组与对照组比较差异均有显著性，同时又是免疫效应细胞，它通过吞噬提呈抗原、激活T淋巴细胞，并分泌和产生多种细胞因子、活性氧及一氧化氮等，诱导肿瘤细胞凋亡及抑制蛋白质合成等作用，是机体免疫应答和免疫调节的重要环节4。实验结果显示壳寡糖能促进巨噬细胞细胞因子IL-1、TNF-和IL-18基因的表达，促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、TNF-和IL-18。而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬

13、细胞和NK细胞，形成 网络 状的反馈调节关系，从而极大地增强机体的免疫功能和抗肿瘤能力。 壳聚糖是 自然 界中第二大生物资源，其降解产物壳寡糖具有无毒、无免疫源性、良好的组织相容性和易溶于水、生物活性高等特点5，可开发成为一种新型的抗肿瘤药物和免疫调节剂。 【 参考 文献 】 1 张虎，杜昱光，虞星炬.几丁寡糖与壳寡糖的制备和功能. 中国 生化药物杂志，1999，20(2)：99. 杜昱光，白雪芳，金宗濂，等.壳寡糖抑制肿瘤作用的研究.中国海洋药物，XX，21(2)：18-21. Ouchi T，Banba T，Matsumoto T，et and antitumor activ-ity of

14、 conjugates of-fluorouracil and chito-oligosaccharides involving a hexamethylene spacer group and carbamoyl Des Deliv，1990，6(4)：281-287. 竺国芳，赵鲁杭.几丁寡糖和可寡糖的研究进展.中国海洋药物，XX，19(1)：43-46. Kim SK，Park PJ，Yang HP，et toxicity of chitosan oligo-saccharide in Sprague-Dawley ，XX，51(9)：769-774. 课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。