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1、项目名称：仿生分子识别技术在生物医学应用的基础研究首席科学家：鞠熀先 南京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容本项目基于生命科学、材料科学、信息科学、肿瘤学、临床诊断学、化学等学科的发展与综合交叉，结合成像、仿生和纳米技术的创新成果，力求将仿生分子识别体系发展成分子识别与早期诊断的有效工具，发现癌变细胞的特异性生物标志物，而发现癌变标志物与药物靶点的筛选又有异途同归、异曲同工的功效，因此可为致癌机制研究与癌症早期诊治新方法的发展奠定基础。围绕这一基本科学问题，将从仿生分子识别体系的弱相互作用及其演化规律、分子识别探针的合成与筛选方法、新型生物标志物的甄定、高
2、灵敏传感与成像方法和癌症的早期诊治与预警研究等几个方面解决相关的科学问题：（1）仿生分子识别体系的弱相互作用规律及其识别探针的设计与筛选：分子识别源于识别探针与目标分子的相互作用，因此仿生分子识别体系基础研究的重点和关键首先是仿生分子识别体系的构-效关系研究和生物作用机制的阐述。通过建立相关的理论模型，可使整个项目的开展在有序和理性的层次上进行，实现识别探针的设计与筛选从“被动模仿”到“主动模拟”的飞跃，提高筛选效率和分子识别性能。（2）新型生物标志物的甄定：制约癌症早期诊断的一个重要因素是特异性生物标志物的缺乏，从体液与癌变细胞质筛选生物标志物又面临方法学的难题和灵敏性的局限。本项目基于核酸
3、适体结构识别高特异性和高灵敏的检测新方法，通过癌变细胞表面受体的核酸适体特征分子图谱与特征分子指纹，甄定新型特异的癌症标志物，为癌症标志物的筛选、早期诊断和致癌分子机制研究提供新的思路。（3）高灵敏仿生分子识别成像与传感方法：癌症早期诊断存在的关键问题是检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性不高。解决仿生分子识别成像与传感方法中的基本科学问题，可建立灵敏、快速、简便、特异的癌症检测方法，实现肿瘤的早期准确诊断与预警。主要研究内容包括：围绕拟解决的关键科学问题，本项目主要开展四方面的研究工作：分子识别体系识别机制的基础研究，分子识别体系的设计与识别探针的合成、筛选及性能研究，基于仿生分子识别
4、体系的高灵敏高选择性的传感与成像方法的建立，生物标志物甄定、癌症早期诊断与预警。具体研究内容如下：（1）分子识别机制与理论模型：利用现代波谱、多维核磁共振、单分子技术等生物物理方法，研究核酸适体、分子印迹材料和纳米生物探针分子识别过程中的分子间弱相互作用，获得识别分子的三维结构信息和分子作用过程的热力学与动力学参数，探讨纳米界面体系探针分子与生物标志物识别的化学本质。根据分子识别过程中所涉及的化学组成、空间结构和结合位点等信息，研究探针与目标分子的识别动力学机制以及受外场的影响，从分子角度出发，利用化学计算、分子模拟和分子设计，开展仿生分子识别体系的构-效关系研究，阐述分子识别的作用机制、表达
5、与变化模式。建立相关的理论模型，为仿生分子识别体系的构建、筛选和性能评估，以及新仿生分子识别体系的设计提供理论指导。这部分工作将是课题1的研究内容。（2）分子识别体系的设计与识别探针的合成、筛选及性能研究：通过仿生、目标筛选、模板诱导、分子裁剪、功能化衍生等手段，设计、合成并筛选具有独特性能的分子识别体系 核酸适体、分子印迹材料和纳米生物探针。在核酸适体筛选方面，将以细胞筛选为重点，发展针对蛋白质、细胞、组织等不同生物靶标在复杂混合体系中核酸适体的筛选方法，并通过对单个碱基、磷酸骨架的化学修饰或使用非天然核酸单体等方法提高核酸适体在复杂环境中的特异性和抗核酸酶降解的稳定性，研究其与靶标结合的亲
6、和力和特异性。在分子印迹材料方面，将以2D分子印迹技术和可控分子印迹技术为重点，结合纳米材料和功能高分子合成领域最新研究成果，考察三维空间结构、氢键、静电力、疏水作用对生物大分子识别的影响；选择癌细胞表面特异膜蛋白作为印迹对象，通过合成膜蛋白的分子印迹纳米材料，实现对癌细胞的识别检测。纳米生物探针的构建与性能研究将首先自主设计、开发特异、灵敏、简便、经济的仿生识别分子与光、磁敏双功能纳米粒子；用这些仿生识别分子修饰多种纳米材料，赋予纳米粒子的仿生识别功能，或用生物识别分子桥联双功能纳米粒子，形成光-磁-生物靶向三功能复合纳米探针，发展用于高灵敏生物传感和生物成像的纳米生物探针，考察探针对单个分
7、子或靶向细胞的识别能力，研究其相互作用的动力学过程，并用于光电磁信号的传导与放大和癌症早期诊断。这部分工作将是课题2与3的主要研究内容。（3）高灵敏高选择性的传感与成像方法：利用仿生分子识别新体系的高选择性和高亲和力，结合仿生分子识别体系功能化方法，综合运用各种纳米技术构建纳米结构生物传感界面，建立癌症标志物的高灵敏高选择性检测新方法。以微纳技术为基础制作纳米传感器识别阵列和微流控芯片，发展微阵列和微芯片检测的信号放大方法，研制高灵敏的光、电传感器件，实现对复杂生物体系中微量或痕量多目标癌症标志物或肿瘤细胞的快速高效检测。将高灵敏的光、电、磁等传感技术与仿生分子识别体系相结合，设计体内、体外和
8、细胞等层面的分子成像系统，建立基于仿生分子识别体系（如光-磁-生物靶向三功能复合纳米探针）的成像新原理、新方法（如双色复合光原理和比色成像、荧光成像与核磁共振成像新方法），实现生理、病理变化的在体、实时、动态、无创三维成像，在细胞和分子水平上特征显示活体内的生物过程，为癌症标志物的甄定、致癌分子机制研究与癌症早期诊断提供灵敏快速便捷的新工具。这部分工作将是课题4的研究内容。（4）生物标志物甄定和癌症早期诊断与预警：以肺癌、肝癌、白血病为对象，建立裸鼠移植瘤模型。用筛选得到的核酸适体分离并获得相应的配体靶标，通过质谱技术和蛋白质序列比对、结构功能预测以及树状分类分析等生物信息学手段分析配体的结构
9、和功能；利用建立的传感与活体成像新方法，获得裸鼠接种成瘤后的癌细胞分子指纹图谱，结合临床表现，探讨癌变细胞表面受体的核酸适体特征分子图谱与指纹的早期诊断价值，甄定癌症早期诊断的生物标志物。通过在体、解剖和离体研究手段，建立癌症早期诊断与预警的新方法，并开发具有自主知识产权的配套诊断系统。这部分工作将是课题2的研究内容之一和课题5的研究内容。二、预期目标本项目面向我国社会发展中提高人类健康的国家需求，以建立与人类健康密切相关的重大疾病（恶性肿瘤）早期诊断新方法为总体目标，通过揭示仿生分子识别的作用机制，合成与筛选仿生分子识别探针，建立高灵敏传感与分子成像新方法；利用仿生分子识别体系的识别和定位功
10、能，甄定新型癌症标志物，为癌症早期诊断与预警提供新原理和新方法，也为生物医学研究提供支撑平台和理论基础。通过开展多学科交叉与综合研究，将为解决生物医学前沿领域和关系人类健康的重大科学问题提供新思路，形成具有原始创新方法学突破及自主知识产权的支撑平台，获得具有国际影响的重要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍。五年预期目标：1. 揭示仿生分子识别体系的基本识别规律，发展几类具有自主知识产权的系统研究弱相互作用的计算化学模型，为仿生分子识别体系的设计、筛选、构-效关系和性能评价提供理论指导。2. 建立针对蛋白质、细胞、组织等不同层次生物靶标的核酸适体筛选方法与可控分子印迹方
11、法，筛选出癌细胞或其特异性标志物的核酸适体6-8种，研制6-8种蛋白质和癌细胞的分子印迹材料与纳米生物探针。3. 发展基于仿生分子识别体系的检测新原理和分子成像新方法，研制出相应的传感器件、多功能生物识别探针、检测与成像系统，其灵敏度超过目前已有方法，为致癌分子机制研究和早期诊断与预警提供高灵敏高选择性的检测方法。4. 建立肺癌、肝癌、白血病等肿瘤细胞的特征核酸适体图谱，提出2-3种特异性高的癌症标志物，并完成仿生分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和新方法。5年内发表SCI收录论文20
12、0篇以上，其中影响因子5以上刊物不少于50篇；获得30件以上发明专利；出版专著2本；获国家级科技奖励1-2项。6. 在仿生分子识别领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的研究人才，包括2-4位国家杰出科学基金获得者。通过项目协作，形成一支在相关领域具有国际影响的学术梯队。三、研究方案（一）总体思路：（1）面向重大需求，带动仿生分子识别体系的基础研究：本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重大战略需求出发，以2009年度973计划综合交叉领域重要支持方向“生命科学与人口健康的重大交叉科学问题” “成像、仿生等技术在生命科学和医学中应用的科学问题和技术基础研究”
13、为依据，发挥分子识别高特异性、高灵敏度的优势，以及仿生分子识别体系高稳定性，可获得病变组织与细胞特征分子指纹的特点，开展仿生分子识别体系的构-效关系研究，形成相应的理论模型，指导仿生分子识别体系的构建与筛选，发展符合人类健康需求的仿生分子识别检测新原理、新方法和新器件，为癌症早期诊断提供特异性生物标志物、分子识别探针、分子识别传感器件与成像系统，满足提升我国人民健康水平的需求。（2）通过学科交叉，发展癌症早期诊治新方法：随着核酸适体、分子印迹和纳米生物探针研究方法的发展和成熟, 仿生分子识别在疾病诊治方面的应用正面临新的机遇。利用我们在仿生分子识别体系基础研究和技术创新方面的优势，通过多学科交
14、叉, 联合国内的优势单位组成跨学科的研究团队（包括化学、生物、纳米、材料, 临床医学等学科），系统地开展成像与仿生技术的基础研究，利用仿生分子识别体系进行癌症早期诊断与预警，将仿生分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现实。（二）技术路线：（1）仿生分子识别体系分子识别机制的研究：根据上述总体思路，本项目首先深入研究生物分子识别规律，利用现代波谱技术、多维核磁共振和现代单分子探针技术揭示仿生分子识别体系与靶标分子的相互作用过程与构-效关系，通过化学计算、分子模拟和分子设计，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、筛选新的仿生分子识别体系，为分子识别体系的性能研究和器件应用提供理论基础。（
15、2）核酸适体筛选方法研究：构建DNA和RNA分子文库，通过对核苷的2位修饰或对磷酸骨架进行巯基修饰等，改善文库的生物稳定性。对已有明确疾病标志物的体系，以过量表达标志物和不表达标志物的细胞做正、反向筛选；对标志物不明确的体系，直接以病变细胞和正常细胞或不同类型的病变细胞做正、反向筛选，优化DNA/RNA吸附分配、配体洗脱、反向筛选对照细胞选取、PCR扩增条件等筛选条件。对筛选出的核酸适体进行测序、二级结构模拟分析、序列裁减后，用流式细胞仪和荧光显微镜等方法表征筛选出的核酸适体与靶标结合的亲合力和特异性。改变实验的温度、缓冲溶液的pH、离子强度等探求核酸适体探针与靶标结合的最佳条件。（3）分子印
16、迹材料筛选方法研究：以纳米材料如石墨烯、纳米金等为蛋白质分子的载体，利用2D分子印迹技术、可控分子印迹技术，在纳米材料表面进行癌症标志物蛋白的分子印迹。通过改变纳米材料表面的疏水性、电荷，以及选择不同的功能单体和交联剂，考察三维空间结构、氢键、静电力、疏水作用对蛋白质分子识别的影响，与课题1所建立的理论模型相结合，优化最佳的蛋白质印迹条件。选择癌细胞表面特异膜蛋白作为印迹对象，通过合成膜蛋白的分子印迹纳米材料，实现对癌细胞的识别检测。结合纳米材料的光、电、磁性能，研究将分子印迹材料的分子识别转化为光电磁信号的方法，探索基于该类型光电磁分子印迹材料的癌症标志物蛋白和癌细胞的检测方法。（4）纳米生物探针的构建方法研究：将仿生分子识别体系与纳米技术相结合构建各种功能化纳米生物探针。首先用多种自主设计的的仿生识别分子或生物识别分子修饰纳米金、量子点、多孔纳米材料、
