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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生物材料中分离纯化淀粉酶实验四淀粉酶的初步分离纯化一、目的和要求1.掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；2.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。3.掌握膜分离原理和方法二、基本原理1.蛋白质的盐析蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷维持胶体的稳定性。由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶
2、解度增大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。2.透析脱盐的原理蛋白质
3、的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围内，不能透过半透膜。选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。这种方法可除去和蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质，是常用来纯化蛋白质的方法。透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。三、试验材料1.培养基种子培养基：牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g葡
4、萄糖/1000mlH2O配100ml发酵培养基：牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g可溶性淀粉2g/1000ml2.酶活测定溶液/PBS缓冲液葡萄糖标准液1mg/mLDNS试剂3.试剂蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、(NH4)2SO4、NaOH、HCl、Na2HPO4?12H2O、NaH2PO4?H2O、EDTA4.仪器或其它用具微量移液器、移液器枪头、透析袋、恒温培养箱、摇床、紫外检测仪、离心机、分析天平、pH计、量筒、250ml瓶、分装架、记号笔、纱布、酒精灯、灭菌锅、干燥箱、恒温水浴锅等；四、试验路线发酵培养粗酶液制备硫酸铵盐析透析脱盐浓缩浓缩酶液酶活测定五、操作步骤1.菌株发酵将实验一中纯化
5、的菌株接入种子培养基摇瓶培养24h，2%的接种量接种到发酵培养基，37，180r/min，培养36h；2.粗酶液的制备发酵液在8000r/min离心20min，收集上清液即为粗酶液，测定酶活方法参见实验三DNS测淀粉酶活力。3.硫酸铵盐析盐析条件的确定40%、60%和80%盐析步骤1）发酵液上清分装至3支烧杯中，每个20ml；2）加硫酸铵至3支烧杯中，对照25硫酸铵饱和度配置表，使其饱和度分别为40%、60%和80%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的轻柔搅拌使硫酸铵完全溶解；3）室温静置2h，出现白色沉淀4）离心，分别取沉淀用少量/PBS缓冲液回溶。4.透析脱盐浓缩透析膜前处理透析袋的预处
6、理方法：1）将透析袋剪成合适的长度；2）在一只250mL的玻璃烧杯中，加入200mL的透析袋处理液，微波炉中预热；3）将透析袋装入其中，电炉上煮沸10min；4）用蒸馏水彻底洗涤；5）蒸馏水中煮10min；6）冷却后4存放，存放过程中透析袋应完全放入/L磷酸酸缓冲液中7用细线扎紧透析袋一端，注入清水检验不漏后加入不超过透析袋体积1/2的须透析溶液。操作1沉淀用少量/PBS缓冲液回溶，移入透析袋中，经透析膜袋在20倍量/L磷酸缓冲液中在室温，36h透析脱盐5.酶活力的测定参照实验三中的酶活测定。实验数据粗酶液540nm盐析40%60%80%七、实验报告1.实验结果测定粗酶液酶活；粗酶液540nm
7、测定透析后酶液的酶活力40%60%80%540nm吸光度酶活力实验结果分析通过比较可知在硫酸铵饱和度为60%时分离纯化淀粉酶酶活力最高。经盐析，透析除盐后酶活力大大提高纯化后的酶活力约为粗酶活力的49倍。六、注意事项硫酸铵饱和度计算及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量见附表。注意看清是25硫酸铵饱和度表清洗透析袋内外时，操作过程中应使用镊子或戴手套；蛋白质溶液用透析法去盐时，正负离子透过半透膜的速度不同。以硫酸铵为例，NH4的透出较快.在透析过程中膜内SO42-剩余而生成H2SO4，而使膜内蛋白质溶液呈
8、酸性，足以达到使蛋白质变性的酸度，因此在用盐析法纯化蛋白质做透析去盐时，开始应用的NH4OH透析，或者用缓冲液配制蛋白溶液。产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1.掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2.巩固十倍稀释法。二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。产淀粉酶菌株在选
9、择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。三、实验材料1.菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2.土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3.培养基：淀粉液体培养基：蛋白胨，NaCl，牛肉膏，可溶性淀粉，蒸溜水50mL。淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏，NaCl1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，。4.其他用品：酒精灯、移液枪、接种环、试管架、三角涂布棒，电子天平、三角烧瓶、试管、培养皿、1mL移液管、10mL移液管(1支)、无菌水
10、、微波炉、卢戈氏碘液。四、试验方法1样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。2富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37，培养24h。3涂布平板分离倒平板将淀粉琼脂培养基融化后倒平板，每平板约15ml。土壤稀释液的制备取富集培养液1mL，放入盛9mL无菌水的试管中，充分振匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和1
11、0-8几种稀释度的土壤溶液。涂布将上述培养基的平板底部用记号笔分别写上10-5，10-6，10-7和10-8四种稀释度字样，每种培养基每种稀释度标记3皿，然后用移液枪分别由10-5，10-6，10-7和10-8四种土样稀释液中吸取菌液放入写好稀释度的平板中央位置，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂满整个平面，室温下静置5-10min。培养将平板倒置在37温箱中培养48h。4.检测观察细菌的生长情况，打开平板盖子，加入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液铺满整个平板，观察是否有水解圈的产生。5产淀粉酶菌株的纯化倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，每平板约15mL平板划线选择在10-5，
12、10-6，10-7和10-8四个稀释度下，每组淀粉琼脂培养基中产生透明圈最大的1个菌落，用无菌水将碘液冲洗掉，挑取远离透明圈的少许菌苔，在3个牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线接种。培养将平板倒置在37温箱中培养48h。6鉴定保存观察细菌的生长情况，打开平板盖子，加入少量卢戈氏碘液于平板种，轻轻旋转平板，使碘液铺满整个平板。观察能产生透明圈的菌落特征，进行初步鉴定，并接种到牛肉膏斜面上保存。五、技术路线富集培养12个）培养12个）培养鉴定保存土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进
13、行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。关键词：土壤淀粉酶产生菌分离纯化发酵培养透明圈法生理生化试验正文：1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化实验原理在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含
14、有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在(来自:写论文网:生物材料中分离纯化淀粉酶)特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。淀粉是有葡萄糖通过-1,4糖苷键构成的直链淀粉和-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和
