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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生物化学预实验报告(共10篇)存车处生物化学综合实验实验报告项目名称：核酸的分离纯化及性质研究指导教师：商亚芳班级：食品科学与工程类13-04班姓名：俞海清学号：XX日期：XX/07/02-07/03小组成员：俞海清曾斯棋核酸的分离纯化及其性质研究摘要：提取植物组织DNA和动物肝脏的DNA，先要破碎细胞，然后通过离心获得沉淀。分理出脱氧核糖蛋白。利用阴离子除垢剂，将蛋白质和DNA分离开来，用氯仿-异戊醇去蛋白质蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，之后用乙醇将DNA沉淀出来，得到粗蛋白
2、质。为了获得高纯度的DNA，采用适量的RNase来降解残留的RNA，再利用乙醇来提取DNA，重复多次来获得较纯的DNA。再利用DNA紫外吸收特性测定DNA的纯度时，发现提取出来的DNA纯度比较高。利用二苯胺法测定DNA的含量，发现DNA含量偏低。DNA产率很低。最后采用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA，测定DNA片段的分子质量。结果实验成功的在紫外线下观察出了标准DNA条带以及待测样品条带。Abstract:InordertoextracttheplantsDNAandtheplucksshouldbreakcells,thenseparatethetheSDStobreakproteinandch
3、loroforMisoaMylalcoholMixturecanmakeproteindenaturation.placeitonthecentrifugalmachinetoremovetheprotein.Then,takelettheDNAdipintocanseparatetheDNA.InordertoobtainhighpurityDNA,usetherightamountofRNasetodegradateresidualRNA,recycledethanoltoextractDNAoverandoverultravioletabsorptioncharacteristicsde
4、terminethepurityofDNA.wefoundthatthepurityofDNAisisusedtocheckthecontentofDNA,thediscoveryofDNAscontentislow.DNAsyieldisvery,agarosegelelectrophoresisusedtoseparateDNAandcheckmolecularweightofDNAtheuvlight,wefoundstandardDNAbandingandthebandingwhichbelongtopendingtextsamplesuccessfully.关键词：DNA分离二苯胺乙
5、醇琼脂糖凝胶电泳氯仿-异戊烷Keywords：DNAseparatediphenylamineethylalcoholagarosegelelectrophoresPhenolchloroforMisoaMylalcoholMixture前言：核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。无论是进行核酸结构，还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。在核酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的
6、各种核酸酶能消化核酸的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。实验原理：1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：DNA存在于细胞核中，天然状态的DNA大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在，从细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖，在将蛋白质除去。阴离子去垢剂SDS可使DNA与蛋白质分离，再用含少量的氯仿去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NACL为例/LNACL中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%；当NACL浓度逐渐增大时，RNP的溶解度
7、变化不大，而DNP的溶解度则随之增加；当NACL的浓度为1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1mol/LNACL提取DNA。进一步制备高纯度的DNA,可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中掺杂的RNA.为了防止提取过程中DNA被细胞中释放出来的DNase降解以及DNA变性，整个提取过程应该在低温度下进行，同时可在研磨缓冲液中加柠檬酸三钠和Na2-EDTA抑制DNase的活性。提取的DNA是否为纯净，双链，高分子化合物，一般要通过紫外吸收，化学测定和电镜观察等方面的鉴定，本实验采用紫外吸收法。2.肝脏中DNA的提取及纯度鉴定原理：在细胞核内，核酸通常是与
8、某些组织蛋白质结合成复合物-核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白形式存在的，因此，在制备核酸时，需先将组织或细胞匀浆或破碎，使之释放出核蛋白，再设法将这两大类蛋白分开，再通过蛋白质变性如苯酚，氯仿等，去垢剂如十二烷磺基硫酸钠或使用蛋白酶处理，除去蛋白质，使核酸与蛋白质分离，从而将核酸与蛋白质分离开。RNP和DNP在不同浓度的电解质溶液中的溶解度差异很大。如在高浓度氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在低浓度氯化钠溶液中,DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此，可以利用不同浓度的氯化钠，将两者分离。将抽提得到的核蛋白用SDS或苯酚处理使核蛋白解聚，DNA/RNA及与蛋白
9、质分开；用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。经上述分离纯化后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，而使其在适当浓度的亲水有机溶剂中呈絮状沉淀析出。重复进行上述处理，即可制成所要求纯度的脱氧核糖核酸制品。提纯的DNA或DNA钠盐为白色纤维状固体。为了防止DNA酶解，提取时加入EDTA。因为EDTA是抑制DNA酶活性最好的抑制剂之一，由于DNA酶的酶解作用必须有Ca2+及Mg2+的存在，故只要在提取液中加入少量的金属螯合剂EDTA，就可使DNA酶失活。本实验采用动物新鲜肝脏为提取DNA的材料，通过组织匀浆，使细胞破碎，利用RNP和DNP在一定浓度氯化钠溶液中溶解度不同的特
10、点，提取DNP。用SDS使蛋白质变性和核蛋白解聚，释放出DNA。用氯仿使蛋白质变性沉淀，离心去除。用乙醇作沉淀剂，得到较纯的DNA。用Rnsae去除RNA，再用氯仿使酶蛋白变性沉淀，离心去除，最后用乙醇作沉淀剂，得到更纯的DNA。DNA纯度鉴定需要测定A260，A230和A280的值，经验数据表明，高纯度DNA样品A260/A280的值在左右，当比值高时说明样品中混杂有RNA，当比值低时表明样品中蛋白质没有脱净；而A260/A230应大于或等于，若比值过小则表明有杂质。因此，可利用A260/A280和A260/A230比值的大小来鉴定DNA样品的纯度。3.二苯胺法测定核酸的含量原理：脱氧核糖核
11、酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成羟基酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。2CCH蓝色化合物酸性条件二苯胺O羟基酮基戊醛=4.DNA的琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳对DNA
12、的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离与它的大小的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未
13、知DNA片段的大小。1.实验仪器与试剂：1.实验试剂以小白菜为材料提取DNA研磨缓冲液：1mol/氯化钠，/L柠檬酸三钠盐，/L乙二胺四乙酸二钠盐，1%的十二烷基硫酸钠,并调到PH=氯仿-异戊醇：氯仿：异戊醇=24:195%乙醇溶液RNase溶液TE溶液：含10mmol/L的Tris-HCL,1mol/L的Na2-EDTA。动物新鲜肝脏。4mol/L氯化钠溶液：将氯化钠溶于水，稀释至1000mL./L氯化钠-/L乙二胺四乙酸钠溶液：溶解氯化钠及乙二胺四乙酸钠于蒸馏水，稀释至1000mL。10%的SDS溶液：25g十二烷基硫酸钠溶于100mL蒸馏水中。15mol/L氯化钠-/L柠檬酸三钠溶液：氯
14、化钠和柠檬酸三钠溶于蒸馏水中，稀释至1000mL.(11)/L氯化钠-/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠和柠檬酸三钠溶于蒸馏水中，稀释至1000mL.溶液：将RNaseA10mg溶解于1mLTE缓冲液中。70%乙醇，95%乙醇。DNA标准溶液：取小牛胸腺DNA用氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。DNA样品液：控制其DNA含量在50100微克/毫升左右。二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸或浓硫酸毫升，混匀备用。临用前加入1毫升%乙醛溶液所配得的溶液应为无色。限制性内切酶Hind试剂盒标准DNA：按使用说明配制标准pBR322：按使用说明配制电
15、极缓冲液：用前稀释10倍称取克Tris，克硼酸，克EDTANa22H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液。溴乙锭染色贮存液：1滴/组将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。1%琼脂糖2.实验器材离心机；752紫外分光光度计，研钵，三角瓶，烧杯，玻璃棒，匀浆器，离心管，恒温水浴箱，量筒，吸量管，真空干燥器，紫外分光光度计，石英比色皿，电泳仪，电泳槽，微量移液器，紫外检测灯，移液管,试管及试管架，凝胶塑料托盘，大小烧杯，一次性塑料手套，紫外反射投射仪，洗瓶，胶头滴管，卡尺。操作步骤：1.植物组织中DNA的提取及纯度鉴定从冰箱取出冷冻30min以上的小白菜幼嫩组织剪碎，放入研钵中并加入12ml研磨缓冲液研磨成匀浆。将匀浆倒入三角瓶内，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分震荡半分钟，以脱组织蛋白，然后离心5m
