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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生化电泳技术实验报告重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称：实验指导教师：学院：专业及类别：学号：姓名：实验日期：成绩：凝胶电泳实验生物学重庆大学研究生院制一、实验目的1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。二
2、、实验材料、用具及试剂1.材料：菌落PCR产物；2.用具：琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器，枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子；3.试剂：琼脂糖，1TAE缓冲液，载样缓冲液，goldviwe染料，DL5,000DNAMarker(Takara)。三、实验原理核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，具有以下优点：便于分离、便于检测和便于回收。其工作原理相对而言比较简单、主要用到了物理学的电荷理论。当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种
3、电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，DNA和RN
4、A多核苷酸链可叫做多聚阴离子(Polyanions)。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔
5、隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。凝胶电泳的分类按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类
6、方法来学习的。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为最适。常用1%的琼脂糖
7、作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验室中常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDSPAGE是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率
8、与分子量的对数间成线形关系。SDSPAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统，其基本原理如下：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，
9、即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。电荷效应当各种离子进入的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。分子筛效应由于分离胶的孔径较小
10、，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点琼脂糖凝胶电泳因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。可用于分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE具有电泳和分子筛的双重作用PAGE是目前最常用的电泳方法。样品量小时间短凝胶结构均匀，孔径较大，设备简单生物化学实验报告醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白刘欣怡XXXX级生物基
11、地班周一下午同组者：刘艺XX年3月25号周一下午一、实验目的1、学习并掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理2、掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作操作。3、学会使用该电泳技术定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。4、记住该电泳中试剂的配制。5、了解电泳技术的一般原理。二、实验器材1、试剂人体血清。巴比妥巴比妥钠缓冲液(，离子强度)：称取巴比妥和巴比妥钠，溶于少量蒸馏水后定容1000ml。染色液：称取氨基黑10B，加入蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。漂洗液：取95乙醇45ml，冰乙酸ml和蒸馏水50ml。混匀，置于烧杯中待使用。透明液：取冰乙酸30ml和无水乙醇70ml，
12、混匀，置于烧杯中待使用。2、仪器及用具醋酸纤维素薄膜28培养皿胶头滴管电泳仪和电泳槽载玻片烧杯单面刀片量筒剪刀镊子盖玻片普通滤纸吹风机擦镜纸三、实验原理1、血清蛋白：蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等
13、电点大部分低于pH值，所以在的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时1、2、球蛋白升高，-球蛋白降低。肝硬化时2、-球蛋白降低，而1、-球蛋白升高。2、醋酸纤维素薄膜原理醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的
14、微孔薄膜，厚度以为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。应用醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点特点A。醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。B。快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳4560min即可，加上染
15、色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。C。灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2l血清，甚至加样体积少至l，仅含5g蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。D。应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。E。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。3、醋酸纤维薄膜电泳有关重点：醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30mi
