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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生化实验报告仪器操作生化大实验实验报告姓名：学号：专业：班级：实验班级：单位：指导老师：实验1多酚氧化酶的分离提取一、实验原理：多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶
2、的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。二、实验目的：通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。三、材料与试剂：1.材料：马铃薯2.试剂：磷酸缓冲液pH配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；磷酸缓冲液pH3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆
3、机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；四、操作步骤：1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min；2.用两层纱布将所得的浆液过滤；3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min；4.上清液两组平分，每组150ml，加硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min；5.取上清液定容至150ml，加入硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min；6.将所得溶液倒入透析袋中，用的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。五、结果和分析：实验所得的初酶液颜
4、色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。六、讨论与结论：1.本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化；2实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果；4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。实验2胰酶
5、分离提取及活性诱导一、实验原理：胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。提取胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀除去。经此多次提取，最后在pH硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在pH时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此pH酶易变性；高于pH时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。二、实验目的：本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同
6、时为亲和层析、免疫学实验准备样品。三、材料与试剂：1.仪器：紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、pH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盘、乳钵，大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、pH试纸，滤纸、玻璃器皿等；2.材料：新鲜猪胰脏；3.试剂及溶液配制：pH乙酸酸化水、H2SO4溶液、2MNaOH溶液、5MNaOH溶液、HCl溶液、HC1溶液、HCl溶液、pH硼酸缓冲液Tris，硫酸铵，pH硼酸缓冲液。四、操作步骤：1.取新鲜猪胰脏1个冰浴下剥除脂肪和结缔组织，用绞肉机绞碎胰脏；2.加1-2倍体积已预冷却的pH乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积算)；3.检查提取液中pH，若
7、高于pH时应及时用10%乙酸调节，使提取液维持在pH之间，在冷室5左右搅拌提取18-24h，4层纱布过滤，用50m1pH乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1-2h)合并滤液，用5MH2PO4溶液调正pH至，过滤，离心30min，取上清，量其总体积；4.盐析加固体粉状硫酸铵，至40%饱和度；盐析1h，1XXrpm离心10min；5.然后上清液加硫酸铵g，至75%饱和度盐析1h，然后1XXrpm离心10min；6.沉淀溶于10mlpH，Tris，透析过夜，4保存。五、结果和讨论：1.经过以上实验步骤得到澄清的酶液。2.用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。3.提取过程中保持pH值之
8、间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。4.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃棒的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白沉淀变性，并注意用量的计算。实验3卵清蛋白的分离提取一、实验原理：鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1：1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量28000，但糖成分上有差别。有四种不同组分，等电点的范围为pH，280nm的消光系数为A=(1%，1cm)。鸡卵粘蛋白在中性或是酸性溶液中和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶的强
9、烈抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。二、实验目的：掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤，为以后进行自己的实验打下良好的基础。三、材料与试剂：1.材料：新鲜鸡蛋2只；2.仪器：抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器；3.试剂：10%TCA，5NHCl，5NNaOH，冷丙酮，胰蛋白酶液，pHTris-HCl缓冲液，pHTris-HCl缓冲液。四、操作步骤：1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25-30，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸-丙酮，立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约，在继续搅拌30min，然后在4放置过
10、夜；2.次日进行离心，得黄绿色清液；3.边搅拌边加入4遇冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4放置2h之后将上清也小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm离心5min，收集沉淀；4.将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水透析4h，换水两次，在对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，10000rpm离心10min，去除不溶物，取少量上清液；5.10000rpm离心10min，取上清液。五、结果和分析：1.经过上面实验得到了较为纯净的鸡卵粘蛋白，呈白色粉末状。2.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。3.在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。实验4柱
11、层析纯化PPO一、实验原理：柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。(1)PPO的基团能被离子交换树脂所吸附从而可以把PPO从溶液中分离出来去掉杂蛋白。在用与树脂离子结合强度比PPO大的洗脱液洗脱就可以得到较为纯净的PPO蛋白。二、实验目的：1.通过离子交换层析和凝胶色谱层析分离纯化PPO的操作，以期掌握柱层析的基本原理、运用及操作技术，并了解凝胶色谱测定蛋白质分子量的基本原理和操作方法。三、材料与试剂：1.材料：实验一所得的PPO粗提液。2.试剂：Tris-HCI缓冲液pH配制时配X10倍浓缩液1000m1；NaCl；聚乙二醇
12、。3.实验器械与仪器设备：试管架、烧杯、玻璃棒、移液管、滴管等、试剂瓶、层析柱PH计和pH试纸恒流泵、梯度混合仪。四、操作步骤：1.DEAE-纤维素的处理及装柱，按照树脂材料的要求对进行处理，将处理好的材料装入洗净的层析柱，柱材装到离柱上端时停止。2.平衡：柱材装好后柱上端进液口接恒流泵，下端出液口连接蛋白检测仪，用Tris-HCl缓冲液对柱材进行平衡，直到仪器的显示数据不再变化为止。3.上样：将粗提酶液上柱，用Tris-HCl缓冲液pH洗脱蛋白。4.洗脱：用含NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，同时用小试管接洗液，每管接到试管的2/3处。共接收8管。五、结果和分析：1.经过柱层析纯
13、化的PPO用的离心管收集，每管收集2/3体积。收集液无色。2.在上样之前一定要平衡好柱子，否则首先洗脱下来的是缓冲液，影响洗脱效率。3,柱子要竖直，以免柱材料表面不水平，从而影响洗脱南方医科大学生物化学实验报告姓名：许梨梨学号：31XX0024专业年级：XX级医学影像学组别：第3实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期XX-10-24合作者评分许琮教师签名氨基酸的薄层层析实验地点指导老师第3实验室何肖娟批改日期一、实验目的1.掌握薄层层析法的一般原理。2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3.掌握如何根据移动速率来鉴定被分离的物质。二、实验原理薄层层析法薄层层析法是色谱分析技术
14、的一种，一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液体在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而能够将样品各组分分离开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来。吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。本实验采用硅胶吸附薄层层析。硅胶吸附薄层层析的特点：1.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。2.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。3.硅胶的活化温度通常为105110，不能过高。氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基酸，与此同时。还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。相对迁移率Rf值的计算混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率Rf值来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。三、材料与方法：实
