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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生化实验报告蛋白质等电点生化大实验实验报告姓名：学号：班级：硕士九班实验班级：一班专业：农药专业王国宾实验一：多酚氧化酶(PPO)的分离提取一、实验目的通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。二、实验原理：1.蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而将PPO蛋白从体系中析出。2.大分子蛋白质不能通过透析膜。三、材料与试剂1.材料：马铃薯(约
2、每小组100-200g)2.试剂：磷酸缓冲液(内含巯基乙醇，5甘油，1的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；磷酸缓冲液(内含巯基乙醇，)配置时配。3.实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL20C高速冷冻离心机；DL一7A大容量低速冷冻离心机。四、操作步骤1.粗酶提取：马铃薯组织按1：1(WV)比例与磷酸缓冲液(内含巯基乙醇，5甘油，1聚乙烯吡咯烷酮)混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。2.盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵
3、使其达到40%饱和度,边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min弃除沉淀，离心上清液再加入固体硫酸铵达到70%饱和度，边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀，沉淀用磷酸缓冲液溶解，装入透析袋中用KCl溶液透析至无硫酸根离子，获得粗酶液供上柱使用。五、实验结果和分析1.初提的酶液为米黄色，经过夜透析后，得到了澄清的略带黄色的液体，可以用来进一步的柱层析。实验二：胰蛋白酶原的提取与分离一、实验目的本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。二、实验原
4、理胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶抑制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其他杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在时最稳定，可在低温下储存较长时间而不失活。低于此pH，酶易变性；高于时，酶易自容而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程宜在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我活化成为有活性的酶。三、实验材料与试剂1.材料：新鲜猪胰脏2.试剂：乙酸酸化水、H2
5、SO4溶液、2MNaOH溶液、HCl溶液、HCl溶液、HCl溶液、硼酸缓冲液、Tris、硫酸铵。四、操作步骤1.胰蛋白酶原的提取与分离称取新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏后，加入2倍体积已预冷的乙酸酸化水提取。在提取过程中，是提取液维持在之间。在冷室5左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液。用50ml乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1-2h，合并滤液，将滤液pH值调至，放置3-5h后，收集滤液，量其总体积。盐析：加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75%饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日4000rpm离心，或用布式漏斗抽滤，滤饼经压干后称重
6、，得到胰蛋白酶原粗制品。2.胰蛋白酶原的激活将胰蛋白酶原组分用10倍体积的冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，量其体积。取出1ml溶液用于测定溶液中硫酸铵的含量。因为硫酸铵可与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程。因此按上述滤饼中含有的硫酸铵与钙结合生成CaSO4之后，尚保存慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调节pH至。3.纯化去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液pH至，抽滤除去硫酸钙沉淀，得滤液。加入已研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40%饱和度。放置5冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀，保留滤液。再向该滤液中加入固体硫酸铵粉末使
7、其溶液达75%饱和度，放5冰箱过夜，次日抽滤收集沉淀压干后称重。五、实验结果与讨论1.得到澄清的酶液。2.用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。3.提取过程中保持pH值之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。实验三：卵清蛋白分离提取一、实验目的掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤。二、实验原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同组份，等电点的范围为pH,280nm的消光系数为：A。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中
8、对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。三、实验材料与试剂1.材料：新鲜鸡蛋2只2.试剂：10TCA；5NHCL；5NNaOH；冷丙酮；胰蛋白酶液；BAEEM；pHTrisHCL缓冲液；pH，MTrisHCL缓冲液。四、操作步骤1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴2530，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸丙酮，立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约，再继续搅拌30min，然后在4放置过夜。2.次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。3.边搅拌边加入4预
9、冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm离心5min，收集沉淀。4.将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，4000rpm离心10min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀释适当倍数，测A280计算所得蛋白总量。五、实验结果与分析1.上清液中得到含有分离提取的卵蛋白，所得卵清蛋白用于胰酶的柱层析。2.在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。3.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。蛋白质的等电点测定及性质实验一、实验目的初步学会测定蛋
10、白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。二、实验原理蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。蛋白质的盐析作用是可逆过程。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。而重金属离子与蛋白质结合成不溶于
11、水的复合物。三、试剂和器材高筋面粉、低筋面粉。1mol/L醋酸。%酪蛋白溶液。称取克酪蛋白，放入烧杯中，加入40的蒸馏水，再加入50毫升1N氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至500毫升，得到略显混浊的、在NaAc溶液中的酪蛋白溶液。鸡蛋白溶液。将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液。要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。质量分数为5%的CuSO4溶液。(NH4
12、)2SO4饱和溶液。天平、水浴锅、移液管、试管等。四、操作步骤1、蛋白质的等电点测定取5支同种规格的试管，编号，按表1顺序精确加入各种试剂，特别注意%酪蛋白溶液最后加入，然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。此时1、2、3、4、5管的pH值依次为、。将上述试管静置于试管架上15min后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记录于表格内，并指出酪蛋白的等电点。注意：本试验各种试剂的浓度及用量均要求很准确，确保缓冲液的pH值准确；浑浊度可用、等符号表示，最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。3、当实验结果与已知发生较大误差时，试着分析其原因。实验二蛋白质的呈色反应，沉淀反应实验人：刘彦汶学号：X
13、X班级：针外XX七同组人：曲畅试验日期：XX年3月15日指导老师：路雪雅一实验目的1了解蛋白质的性质。2掌握蛋白质的鉴定方法。3理解蛋白质呈色反应和沉淀反应原理。二实验内容1蛋白质的呈色反应。2蛋白质的沉淀反应。三实验器材水浴锅，试管，烧杯，一次性滴管，酒精灯，漏斗，火柴，滤纸四实验试剂11：10鸡蛋白溶液210%NaOH31%硫酸铜4尿素501%茚三酮乙醇液6025%丙氨酸溶液7饱和硫酸铵溶液8固体硫酸铵905%NaOH1005%硫酸锌1110%磺基水杨酸1210%Hcl131%HAc1410%HAc15.无离子水五实验原理及操作步骤蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应是蛋白质中某些氨基酸特殊基
14、团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应，可作为检查蛋白质是否存在的参考。另外，不同的蛋白质中氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质内还可能缺乏呈某种颜色反应的氨基酸。因此不但不同蛋白质呈色反应的强度不同，而且某些呈色反应在某种蛋白质可能不存在。本实验操作两种呈色反应：双缩脲反应与茚三酮反应，用以比较和鉴别不同的蛋白质。1双缩脲反应【实验原理】在浓碱液中，双缩脲能与硫酸铜结合生成紫色或紫红色的复合物，这一呈色反应为双缩脲反应，凡含有两个及多个肽键的化合物都可能发生此反应，故蛋白质及二肽以上的物质都有此反应，但除肽键外，有些基团如CSNH，CNH等也有双缩脲反应，因此，一切蛋白质或多肽都有
15、双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。【操作】取小试管一支，加1：10鸡蛋白液2滴，10%NaOH溶液5滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，可见溶液变成紫色。另取一小试管，加一小匙尿素，小火加热至熔，嗅其气味为。继续加热使之凝固，这固体是，加水10滴，10%NaOH溶液5滴，1%硫酸铜溶液2滴，可见白色固体溶解，后溶液变紫色。实验结论在过碱条件下，蛋白质可以和硫酸铜发生双双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。2茚三酮反应【实验原理】凡含有自由氨基的化合物例如蛋白质，多肽，各种氨基酸和其它伯胺化合物与茚三酮共热时，能生成紫蓝色化合物，这种反应即茚三酮反应。【操作】注意：用酒精灯加热时，酒精灯不要随便移动，加热试管口不能对着人，不能用吹气的方式熄灭酒精灯，以免出现危险情况。1号试管中，蛋白质与茚三酮共热时，发生茚三酮反应；2号试管中，由于丙氨
