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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划生化实验报告思考题生化实验讲义思考题参考答案实验一淀粉的提取和水解1、实验材料的选择依据是什么？答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。2、材料的破碎方法有哪些？答：(1)机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法；(2)物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等；
2、(3)化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。实验二总糖与还原糖的测定1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？答:我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。实验五粗脂肪的定量测定索氏提取法本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。本实验样品制备时烘干为什么要避免过热?答：防止脂质被氧化。实验六蛋
3、白质等电点测定1、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？答:在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。实验七氨基酸的分离鉴定纸层析法1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？答:将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸
4、斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？答:实验八蛋白质含量的测定(1)简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。答：原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。实验十影响酶活性的因素本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系
5、列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉紫色糊精红色糊精麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。因此反应后颜色如为蓝色说明酶活力低，淡黄色则说明酶活力高。如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？答：淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此，产生红棕色氧化亚铜的沉淀越多说明酶活力越高。通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？答：温度、pH、激活剂、抑制剂等。高于或低于
6、最适温度或pH，酶活力都会降低；激活剂和抑制剂不是绝对的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。实验十二碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定(1)试说明用硫酸铵分级分离酶的方法及应注意的事件。答：用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大，并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。例如：某酶发生盐析的范围为35-65%饱和硫酸铵的浓度，因此可先选择30%饱和硫酸铵浓度，去沉淀杂蛋白，然后选择70%饱和硫浓度酸铵，留沉淀。注意事项：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的改变而改变。在加硫酸铵时，需事
7、先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。(2)用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高，这是为什么？答：因为碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白，正丁醇处理后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出来。(3)酶活力测定时，为什么必需先将酶液对缓冲液透析后才测定？答：去除盐离子的影响。实验十三凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶1.在本实验中要注意哪些重要环节？答：1）注意区分柱子的上下端。2）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。3）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不
8、宜过快，避免因此凝胶。4）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。5）核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器要正确连接。6）要控制一定流速。7）收集得到的液体要进行酶活力的检测。实验十四底物浓度对酶活力的影响1.在测定酶催化反应的米氏常数Km和最大反应速度Vm时，应如何选择底物浓度范围？答：底物浓度选择范围S?Km为宜。底物浓度选取还应该注意其倒数能均匀分布。1/v1/v01/S01/S底物浓度太大底物浓度太小2.试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。答：(1)Km是酶的一个极重要的动力学特征常数，Km物理含义：ES络合
9、物消失速度常数与形成速度常数之比；其数值相当于酶活性部位的一半被底物占据时所需的底物浓度。(2)可根据Km估计底物浓度的水平。(3)Km可作为同工酶的判断依据。(4)鉴别最适底物。(5)有助于在酶学研究中对底物浓度的选择。选用S10Km浓度进行活力测定3.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？答：某种酶的Km在给定的体系中不随酶浓度改变而改变，也与酶的纯度无关，因此是酶的一个特征常数。但Vm随酶浓度改变而改变。实验十七SDS-PAGE电泳(1)简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理;答：1）SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。2
10、）SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使SDS与蛋白质的复合物都带上相同密度的负电荷。3）SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状一样，都是近似于雪茄烟形的长椭圆棒。4）不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。(2)是否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定得到的分子量都完全可靠？答：不是。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS
11、，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。实验十八维生素C的定量测定简述本法测定VC的利与弊。答：碘量法测定VC相比其它方法传统的碘滴定法迅速、简捷，但易受到待测物颜色干扰而不易判断滴定终点；只能测定待测溶液还原型的Vc含量，如果溶液中还含有其他还原型较实验二酵母核糖核酸的水解及组分鉴定原理：酵母核酸中RNA含量较多。加硫酸煮沸可使RNA水解，可以生成戊糖，碱基和磷酸。各种成分以下列反应鉴定1,核糖与苔黑酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。2,嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化物沉淀。3,
12、磷酸与钼酸铵试剂作用能产生黄色的磷钼酸铵沉淀。思考题现有三瓶未知溶液，分别是蛋白质，糖和RNA，常用什么试剂或方法进行鉴定？糖应该是用斐林试剂会出现砖红色沉淀；蛋白质是双缩脲试剂会出现紫色反应RNA是用吡罗红检测的会出现红色反应实验三天然产物中重要营养功能成分的提取和测定原理：在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色的络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。其颜色的深浅与蛋白质分子量级氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。思考题怎样分离卵磷脂和简单脂?可以用丙酮分离卵
13、磷脂和简单脂，因为卵磷脂溶于有机溶剂但不溶于丙酮。写出卵磷脂的结构式，指出哪一部分是极性部分，哪一部分是非极性部分？OHlR-CH-O-P=OlOR为什么卵磷脂是良好的乳化剂？卵磷脂属于一种混合物，是存在于动植物组织以及卵黄之中的一组黄褐色的油脂性物质，其构成成分包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂有时还是纯磷脂酰胆碱的同义词。从化学名称可见卵磷脂主要成分为纯磷脂酰胆碱，是一种含有两亲基团的离子型表面活性剂，亲油端为长链的油脂、磷脂、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯等，亲水端为胆碱的部分基团，胆碱在化学上为三甲基氨的氢氧化物。胆碱胆碱呈无色味苦的水溶性白色浆液，有很强的
14、吸湿性，暴露于空气中能很快吸水。胆碱是季胺碱。符合表面活性剂中乳化剂的条件。实验四温度和调节剂对酶活性的影响原理：酶促反应开始时，反应速度随温度升高增快。达到最大反应速度是的温度称为某种酶的最适温度。当达到最适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以致完全停止。氯化钠喂唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。思考题何谓酶的最适温度和最适PH？最适温度：酶促反应开始时，反应速度随温度升高增快。达到最大反应速度是的温度称为某种酶的最适温度。最适PH:在一定pH值范围内酶的活性是随温度的变化而变化的,其趋势是先上升在下降,之间的最高点既是最适pH值说明温度，PH和抑制剂对酶反应速度的影响pH、温度、抑制剂通过影响酶的活性来影响酶促反应的速率。pH和温度的变化情况不同，既可以降低酶的活性，也可以提高，所以它们既可以加快酶促反应的速度，也可以减慢；抑制剂都会降低酶的活性，使酶促反应的速度降低南方医科大学生物化学实验报告姓名：许梨梨学号：31XX0024专业年级：XX级医学影像学组别：第3实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验日期XX-10-24合作者评分许琮教师签名氨基酸的薄层层析实验地点指导老师第3实验室何肖娟批改日期一、实验目的1.掌握薄层层析法的一般原理。2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3.掌握如何根据移动速率来鉴定被分离的物质。二
