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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划材料溶解度,细胞毒性附件四指导原则编号：药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重
2、组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，
3、在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。二、基本原则实验管理药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据中华人民共和国药品管理法的规定，必须执行药物非临床研究质量管理规范。具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合
4、上述信息对试验结果进行全面的分析评价。随机、对照、重复遗传毒性试验应符合毒理学试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。三、基本内容受试物1、中药、天然药物受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。2、化学药物受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量、保存条件及配
5、制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。试验设计的总体考虑对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价，遗传毒性试验可用作鉴定体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物的试验，也可在整体动物上进行体内试验；根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤与修复；从试验系统来分，遗传毒性试验可分为体内试验和体外试验。因体内和体外试验差异较大，以下分别讨论体外试验和体内试验的基本要
6、求。由于体内外的试验方法均较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，具体试验时需根据具体情况具体分析。1、体外试验基本要求细菌回复突变试验中采用的基本菌株在细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶位点碱基臵换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌；TA98；TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶位点碱基臵换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA。由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加一种修复准确型大肠杆菌
7、）。体外试验中最高浓度的确定体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。无毒化合物的高浓度对易溶解的无毒化合物，细菌试验应达到的最高浓度为5mg/皿，哺乳动物细胞试验为5mg/ml或10mM。要求达到的细胞毒性水平在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又可影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。当哺乳类动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性会导致遗传毒性的假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳类动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平：
8、在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，如回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率，对培养的淋巴细胞，有丝分裂指数抑制率应高于50%。哺乳动物细胞体外基因突变试验中，理想的最高浓度应能产生至少80%毒性。可通过评价平板接种效细胞冻存及复苏一、【实验目的】1、掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存实验方法2、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。二、【实验原理】低温液氮冻存贮存细胞是细胞培养室常规通用技术。这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会
9、；并防止了在多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。液氮中温度可达-196，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。为培养工作提供了极大的方便。在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生甘油和二甲亚砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对
10、水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有一定的保护作用。保护剂的使用浓度一般在5%15%。降温方法：使用降温仪：以-1-2/min的降温速率-25以下以-5-10/min的降温速率-100迅速浸入液氮中。分步降温：4放置3060min-70-80放置12天迅速浸入液氮中。三、【实验仪器与试剂】1、仪器：4冰箱，-70冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。2、材料：冻存管，离心管，细胞培养用材料，500mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75酒精棉球。3、药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，025胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜(DMSO)或甘油，05台盼蓝染液，液氮。四、【实验步骤与内容】
11、1、细胞悬液的准备1）75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。2）取对数生长期的细胞，将培养液倒入废液缸中。向培养瓶内加入3mlPE液，平放轻摇。3）向培养瓶内加入的%胰蛋白酶消化液，轻摇。拍打悬浮后，制备成单细胞悬液。2、冻存1）取对数生长期细胞，在冻存前24小时换培养液一次。2）按上步骤制成细胞悬液。3）在细胞悬液中加入2ml冻存液，吹吸数次使细胞均匀悬浮，取ml分装入细胞冻存管内，密封，在管上做好标记，放于小试管架上，放入45冷藏箱中3045分钟，使冷冻保护剂充分渗入细胞内，与细胞达到平衡，放入-75，1天，快速放入液氮罐的试管托内，沉入液氮中。为保持细胞最大存活率，复苏细胞与
12、冻存细胞要求相反，应采用快速融化的手段，这样可以保证细胞外的结晶在很短的时间内即融化，使细胞迅速通过最易受损的-50温度段，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。3、复苏1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入3637恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在4060秒内尽快解冻。2）用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3mlMEM血清培养液，摇匀后静置，30min后在显微镜下检查贴壁情况大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2mlMEM血清培养液置培养箱中培养从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。五、【实验注意事项】1、实验操作人员
13、在冻存复苏细胞过程中，要有自我保护意识，避免被液氮冻伤。操作时应带好眼镜和手套。2、冻存时，应仔细检查细胞冻存管是否密封，以免复苏时因受热发生爆炸伤人。3、液氮罐应存放于通风良好处，以便氮气逸出后散开，液氮量应定期检查，挥发至一半时要及时补充。4、细胞冻存悬液一旦融解后，应尽快弃除冷冻保护液，因二甲亚砜在常温下对细胞会产生毒性。六、【实验思考题】1应如何运用“缓慢冻存，快速复苏”的原理保存细胞?答：细胞内冰晶损伤是指细胞内部结冰而致的细胞损伤溶质损伤，电解质浓度过高而引起细胞损伤，通过缓慢冻存，进行阶段性降温。快速复苏，骤然升温，避免水重结晶，减少冰晶损伤。添加冷冻保护剂，如甘油或DMSO以5
14、的终浓度加到培养液中，起到保护细胞的作用。2冻存液的作用是什么?答：1）降低细胞的冰点；2）提高细胞膜对水的通透性3）稀释细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而减少溶质损伤。3、查阅有关资料，简述5项近年来细胞冻存的研究成果和应用。1、液氮法目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减
15、少冰晶对细胞的损伤。2、玻璃化法玻璃化保存是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。3、非玻璃化冻存法通过采用“缓慢冻存”、“快速复苏”、“冷冻保护剂”等措施来减少冰晶损伤。缓慢冻存-进行阶段性降温、快速复苏-骤然升温，避免水重结晶，减少冰晶损伤。冷冻保护剂-甘油或DMSO以5的终浓度加到培养液中，起到降低细胞的冰点；提高细胞膜对水的通透性；稀释细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而减少溶质损伤。医用羟基磷灰石的研究进展摘要：羟基磷灰石(HA)是人体骨、牙无机组成的主要成分，组成生物体骨、牙组织的磷灰石晶体为纳米级、低结晶度、非化学当量和被多种离子的置换的针状纳米微晶纳米羟基磷灰石由于与生物硬组织结构成分相似，以及
