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1、RNA 表观遗传伊成器Outline：I A brief history of epigeneticsII. N6-methyladenosine（ m6A）重点：Writer、erasers、reader、检测方法、功能1. discoveries of two m6A demethylases (erasers)2. identification of the methyltransferase(s) (writers)3. How to detect transcriptome-wide m6A? (sequencing tools)4. Functional relevance: ro
2、le of m6A in mESCs5. Readers: m6A binding proteins Beyond reader proteins: indirect read-out6. Summary of the m6A partIII. epitranscritpome sequencing 中心法则：DNARNAProtein 每一个过程都有相应的表观遗传修饰表观遗传修饰的特征：不改变 DNA 序列；表型差异；遗传性IA brief history of epigenetics1.发展Conrad Waddington(1942):EpigeneticsDevelopment is
3、epigenetic核移植技术的发展 体外改变细胞命运表观遗传学组分生物化学的研究：2.DNA 的表观遗传修饰 5-甲基胞嘧啶在高等生物中比较普遍的 DNA 修饰方式主要是胞嘧啶甲基化，在 DNA 甲基转移酶（DNMT）的作用下生成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC ） 。去甲基化可以通过 Tet 家族双加氧酶，转化成 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC） ，Tet 双加氧酶可以将 5mC 和 5hmC 氧化成 5-胞嘧啶羧基（5caC） ，之后 5caC 会被胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶（TDG）识别并消化功能：通过甲基将蛋白质结合到其同源的 DNA 序列，直接干预，影响转录因
4、子的结合；通过招募与 5mC 结合的蛋白来压缩染色质3.组蛋白表观遗传修饰通过组蛋白的修饰来调节基因的表达表观遗传修饰三元件：writer reader eraserWhere is RNA epigenetics？DNA isnt the only decorated nucleic acid in the cell. Modifications to RNA molecules are much more common and are critical for regulating diverse biological processes.哺乳动物 DNA 上第 5 个碱基在动物中特异性的
5、在 CpG 二核苷酸中发现人中 CpG 的 70-80%的胞嘧啶（ C）是甲基化的II. N6-methyladenosine（m6A） RNA epigenetics 的最好的发现腺嘌呤第 6 位氮原子上的甲基化修饰 (N6-methyladenosine, m6A) 是高等生物mRNA 中含量最为丰富的在进化上保守的修饰之一。 m6A 修饰具有序列特异性、甲基化位点选择性及修饰水平动态性特征，由 RNA m6A 甲基转移酶复合物WTAP/METTL3/METTL14 催化形成及去甲基化酶 ALKBH5 和 FTO 催化去甲基化，并被结合蛋白 YTHDF2 和 YTHDC1 识别。m6A 修
6、饰调控靶基因 mRNA 的稳定性及选择性剪切。1. discoveries of two m6A demethylases (erasers)早在四十年前，人们就发现信使 RNA 上存在着腺嘌呤上的甲基化修饰（ m6A） 。这种 m6A 修饰非常普遍，出现频率大约是 3-5 个残基/mRNA。不过当时人们并不清楚这种修饰有何功能。2007 年研究人员发现了 A novel family of RNA/DNA demethylase，FTO， the fat mass and obesity associated 第一个发现的 m6A 去甲基化酶2011 年研究者们发现，一种被称为 FTO（fa
7、t mass and obesity-associated protein）的酶能够催化 m6A 去甲基化。在这篇文章中，研究人员通过体外模拟生理环境下的去甲基化反应条件，将 FTO 的野生型和突变型蛋白分别与甲基化底物共同孵育，利用质谱和高效液相技术，对多种甲基化形式进行探索，最终发现 FTO 对单链 RNA 上的 m6A 具有去甲基化功能。同时，体内实验验证，在FTO 基因敲除细胞中 mRNA 中的 m6A 水平升高；相反，在 FTO 过表达细胞中mRNA 中的 m6A 水平降低；而 m6A 甲基化酶 METTL3 的表达均未受到影响。免疫荧光实验证实 FTO 存在于细胞核中，且与编码 R
8、NA 加工相关的核散斑体显示了部分共定位。表明 FTO 有可能通过调控 mRNA 上 m6A 甲基化的逆转参与了mRNA 加工。FTO 因其在大量不同人群中被证实与肥胖紧密相关，被定义为第一个肥胖基因。“我们第一次证实这种甲基化修饰受到了肥胖相关蛋白 FTO 的调控，并在维持人类能量动态平衡中发挥关键性的作用， ”何川教授说。作为首个被发现的 m6A 去甲基化酶，FTO 属于一类催化大量氧化反应的酶家族。研究者们对这些酶进行系统性分析，发现该家族中的另一个成员 ALKBH 也是一种 m6A 去甲基化酶。FTO 和 ALKBH5 都位于细胞核的核斑（nuclear speckle）中，这里是剪切
9、因子的聚集地。人们推测，m6A 甲基化对剪切的影响与上述定位有关。研究显示，在体外培养的细胞中抑制 ALKBH5，会影响约 3000 个 mRNA 亚型。此外，ALKBH5 缺陷型小鼠虽然表面上可以正常长大。但缺乏这种去甲基化酶的雄性小鼠是不育的。ALKBH5 是第二个发现的 m6A 去甲基化酶2. identification of the methyltransferase(s) (writers)2014 年研究人员发现 A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation并鉴定出
10、了 METTL3-METTL14 复合物与 RNA 的结合位点METTL3 、METTL14 、WTAP 是 m6A 的甲基化酶3. How to detect transcriptome-wide m6A? (sequencing tools)RNA 中的 A 和 m6A 都和 DNA 中的 T 配对，Next generation sequencing 测序时会将 m6A 的修饰清除，测序无法检测到 m6Am6A-seq capture of modified RNA fragments exposes an enriched motif.RNA 样品打碎成片段加入 anti- m6A 的
11、抗体免疫共沉淀洗涤出RNA随机制备 cDNA 文库测序m6A 的转录组测序结果显示 m6A 在 3UTR 含量较丰富m6A 在进化上是高度保守的4. Functional relevance: role of m6A in mESCsMETTL3 能促进 ESC 的自我更新，增加体细胞重编程成 iPSC，METTL3 KO 阻断细胞在体内的定向分化m6A 可以增加 mESCs 的多能性5. Readers: m6A binding proteins Beyond reader proteins: indirect read-out以上研究发现了 eraser，writer，还缺少 reader
12、 来识别 m6A。在最近的一项研究中，研究者们鉴定了特异性识别 m6A 的 RNA 结合蛋白YTHDF2。YTHDF2 的结合大量出现在甲基化的 mRNA 上，在体内和体外都选择性的结合在含 m6A 的 RNA 上。此外，核糖体图谱（ ribosome profiling）和免疫荧光技术显示，YTHDF2 的结合导致 mRNA 从翻译中的核糖体转移到细胞质的 P-body，并在那里被降解。而且 mRNA 的降解程度与其甲基化位点数有关。研究显示，抑制 YTHDF2 可以增加目标转录本的稳定性。核糖体图谱（ribosome profiling）是一种核糖体序列分析技术，能够对进行蛋白质活跃翻译的
13、特定转录组组分进行确定。YTHDF2 特异性识别 m6A 的 mRNA，并介导 mRNA 的降解Working model of YTHDF2之后又发现了另一个 m6A readerYTHDF1近期何川和其同事又鉴定出另一个 m6A reader proteinYTHDF1，与 YTHDF2的功能不同，YTHDF1 通过增加翻译器的效率刺激蛋白质的合成Knockdown of YTHDF1 Leads to Reduced Translation of Its mRNA TargetsThe N-Terminal Domain of YTHDF1 Promotes Protein Produc
14、tion in a Tethering AssayYTHDF1 Associates with Translation Initiation Factors and RibosomeYTHDF1 特异性识别 m6A 的 mRNA，并促进蛋白质的翻译合成YTHDF1 在细胞核内的功能Structural basis of preferential recognition of the GG(m6A)C consensus motif by the YTH domain（YTHDF1/2 的 YTH domain 优先识别的结构基础是 GG(m6A)C 基序）What about m6A in t
15、he 5-UTR?Altered m6A profiles in MEF cells in response to heat shock stress（热应激）.m6A modification promotes selective translation under heat shock stress在热应激下 m6A 结合到 5-UTR 增加，促进选择性的翻译，可能与热激蛋白表达有关5-UTR 的 m6A 可以促进不依赖与 Cap 的蛋白质翻译6. Summary of the m6A part功能：a.结合蛋白质 b.维持 RNA 复合物的稳定性 c.剪切d.促进蛋白质翻译 e.提高 m
16、RNA 的稳定性 f.降解 mRNAWriter（甲基转移酶）：METTL3 METTL14 WTAPErasers（去甲基化酶）：FTO ALKBH5Reader（m6A 结合蛋白）：YTHDF1 YTHDF2 YTHDF3III. epitranscritpome sequencing 表观转录组学测序1. high throughput sequencing platformsSingle-Molecule, Real-Time (SMRT) Sequencing Method 单分子实时测序要实现单分子实时测序，有三个关键的技术：第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入 DNA 链的时候，它
