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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划双荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因分析1.介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影
2、响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR报告基因检测系统，Verita
3、s?软件中预装了DLR的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II(LARII)最低可以检测到1X10-19mol荧光素酶分子，使用Stop&Glo?试剂可以检测到1X10-18mol海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8和6个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。图13使用Promega公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19到1x10-11mol)和海肾荧光素酶(1x10-14mol)在Modulus?仪上测量结果。
4、2.所需器材?Veritas?微孔板发光检测仪(P/N9100-002)?96孔白板(E&KScientificEK-25075)?Dual-LuciferaseReporter?荧光素酶检测系统(E1980)?P200移液器和枪头3.实验方案试剂制备荧光素酶检测缓冲液II和荧光素酶检测底物：使用所提供产品，20储存，可以稳定保存6个月，荧光素酶检测底物可以4保存1个月。将荧光素酶检测缓冲液II加入荧光素酶检测底物中，配制DLR工作液，颠倒混合，直到底物彻底溶解。配好试剂最好当天使用，也可以将配好试剂分装，-20C储存1月，-70储存1年。Stop&Glo?底物和Stop&Glo?底物缓冲液：
5、使用所提供产品，20储存。Stop&Glo?底物溶解缓冲液：使用所提供产品，低于25储存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸树脂管中将50Stop&Glo?底物稀释成1Stop&Glo?工作液。颠倒混合，工作液最好当天使用，也可以将工作液分装，-20C储存2周。被动裂解缓冲液：用去离子水将5x被动裂解缓冲液稀释成1x的，低于25C保存。注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferase?荧光素酶缓冲液II和Stop&Glo?缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。仪器安装双击Veri
6、tas图标运行软件；从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在OtherOptions面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击ApplyChanges双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项转载请注明来自丁香园发布日期：XX-03-2613:43文章分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键
7、词：双荧光素酶报告基因载体点击次数：24521报告基因检测受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。2细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。3双荧光素酶报告基因的载体选择：a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强(来自:写论文网:双荧光素酶报告基因)启动子，而选用中等强度的启动子。4双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调
8、整，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。5最适反应温度：室温。各个组分都需要调整到室温。6双荧光素酶反应体积：20ul-100ul-100ul，底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差7细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20一个月；-80半年8裂解产物与底物混合：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。9发光半衰期：a)单荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12minb)双荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min10检测结果检测前应检测孔板或空管的发光值，
9、作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。双荧光素酶报告基因分析转载请注明来自丁香园发布日期：XX-04-0810:59文章关键词：双荧光素酶基因表达报告基因检测1.介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时
10、表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F1
11、2等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II(LARII)最低可以检测到1X10-19mol荧光素酶分子，使用Stop&Glo?试剂可以检测到1X10-18mol海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8和6个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。图13使用Prome
12、ga公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19到1x10-11mol)和海肾荧光素酶(1x10-14mol)在Modulus?仪上测量结果。2.所需器材?Veritas?微孔板发光检测仪(P/N9100-002)?96孔白板(E&KScientificEK-25075)?Dual-LuciferaseReporter?荧光素酶检测系统(E1980)?P200移液器和枪头3.实验方案试剂制备荧光素酶检测缓冲液II和荧光素酶检测底物：使用所提供产品，20储存，可以稳定保存6个月，荧光素酶检测底物可以4保存1个月。将荧光素酶检测缓冲液II加入荧光素
13、酶检测底物中，配制DLR工作液，颠倒混合，直到底物彻底溶解。配好试剂最好当天使用，也可以将配好试剂分装，-20C储存1月，-70储存1年。Stop&Glo?底物和Stop&Glo?底物缓冲液：使用所提供产品，20储存。Stop&Glo?底物溶解缓冲液：使用所提供产品，低于25储存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸树脂管中将50Stop&Glo?底物稀释成1Stop&Glo?工作液。颠倒混合，工作液最好当天使用，也可以将工作液分装，-20C储存2周。被动裂解缓冲液：用去离子水将5x被动裂解缓冲液稀释成1x的，低于25C保存。注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferas
14、e?荧光素酶缓冲液II和Stop&Glo?缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。仪器安装双击Veritas图标运行软件；从WelcometoVeritas对话框中点击RunPromegaProtocol；浏览DLR文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择DLRwithoneinjection.；点击Options选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在OtherOptions面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结
15、束，点击ApplyChanges确认修改，或者点击SaveProtocolAs保存修改方案。另外也可以点击Options返回MainDialogBox；在MainDialogBox.中输入个人信息，例如Experiment,Operator,PlateNo.,andNotes。样品分析准备含有裂解细胞培养物的96孔板；注：为了保证数据良好的重现性。加入试剂前，室温下平衡细胞培养基；准备注射器。将注射器1进样口放入LARII，将注射器2进样口放入Stop&Glo?试剂瓶，在MainDialogBox上用Prime键对注射器进行初始化；注：不能混用注射器。Stop&Glo?试剂对萤火虫荧光素酶活性有猝灭作用。建议一个注射器专门吸入Stop&Glo?，另一个专门吸入LARII；样品板放入Veritas?微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测。检测结束后，所有需要检测的样品
