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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划双缩脲反应的实验报告范文目录实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应.0实验二氨基酸的分离鉴定纸层析法.5实验三蛋白质的性质实验.7实验四血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.9实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.12实验六血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳.14第二部分附录.17附录实验室规则与应急处理.17附录实验记录和实验报告的书写.18附录实验室基本操作.19附录实验所需的药品、试剂的配制.22附录实验所需的设备及其使用方法.25实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的和要求1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊
2、颜色反应及其原理。2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法。二、仪器与试剂仪器1、试管；2、试管架；3、恒温水槽；4、酒精灯；5、电吹风机；8、分析天平。试剂1、蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释1020倍，多层纱布过滤，滤液4oC保存；2、氢氧化钠溶液：称取NaOH，蒸馏水溶解并定容至200mL；3、硫酸铜溶液；称取CuSO4，蒸馏水溶解并定容至200mL；4、甘氨酸溶液：色氨酸溶液：酪氨酸溶液：精氨酸：组氨酸溶液：苯丙氨酸酸溶液：蛋氨酸溶液：半胱氨酸溶液：分别称取各氨基酸，蒸馏水分别溶解并定容至200mL，4oC保存；5、茚三酮水溶液：称取茚三酮，蒸馏水溶解并定容至100mL；6、茚三酮-乙
3、醇溶液：称取茚三酮，乙醇溶解并定容至100mL，即用即配；7、头发，指甲屑；8、浓硝酸：浓盐酸；浓硫酸；冰醋酸；9、苯酚溶液：称取苯酚，蒸馏水溶解并定容至200ml；10、-萘酚乙醇溶液：称取-萘酚，95%乙醇溶解并定容至100ml即用即配；11、NaBrO溶液：2克溴溶于100ml5%NaOH中，置棕色瓶中，可在暗处保存两周12、鸡蛋清：13、偶氮试剂：溶液A；溶液B；A、B溶液分别保存在密闭瓶中，用时以等体积混合。14、醋酸铅溶液：称取Pb(Ac)2，蒸馏水溶解并定容至100ml；15、醋酸铅试纸：将滤纸条浸入10%醋酸铅溶液中，湿透后取出，100oC烘干即可。三、实验内容对蛋白质及氨基酸
4、的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、坂口反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等进行定性确定。双缩脲反应1、实验原理当尿素加热到180oC左右时，两个分子的尿素缩合成双缩脲并放出一个分子氨，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成红色络合物，即双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能发生此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。OC+NH222OCOC2+HNHNOONHOCNH222+OOCCHNH2+HN尿素双缩脲双缩脲络合物2、操作取一支试管，加入适量尿素，酒精灯加热至熔化，冷却至室温后；加入约1ml和10%NaOH溶液2ml，摇匀，再加1%CuSO4溶液两滴，随加随摇。
5、观察颜色变化。取4支试管，按下表操作。42茚三酮反应1、实验原理除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。2、操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和%甘氨酸溶液各1ml，再各加%茚三酮水
6、溶液ml，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。取4支试管，按下表操作。在一块小滤纸上滴一滴%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴一滴%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘烤，观察出现的现象。黄色反应1、实验原理蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物，该衍生物在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。2、操作取6支试管编号后分别按下表所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火
7、加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%NaOH溶液直至碱性，观察颜色变化。坂口反应1、实验原理蛋白质在碱性溶液中与次溴酸盐和-萘酚作用产生红色的产物，这是由于蛋白质分子中精氨酸残基中的胍基的特征性反应。许多含胍基的分子也发生此反应。精氨酸是唯该正反应阳性的氨基酸，反应灵敏度达1：。生成的氨可被次溴酸钠氧化生成氮。在次溴酸钠缓慢作用下，有色物质继续氧化，颜色消失，因此过量的次溴酸钠对反应不利。加入浓尿素，破坏过量的次溴酸钠，能增加颜色的稳定性。2、操作按下表向各管中加入试剂，记录出现的现象。乙醛酸反应1、实验原理含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反
8、应机理尚不清楚。含有色氨酸的蛋白质有此反应。2、操作取3支试管，编号，分别按下表操作。偶氮反应1、实验原理偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则产物应分别为橙红色和樱桃红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色生此反应而显色。2、操作取3支试管编号，按下表分别加入组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各45滴，再分别加重氮试剂810滴，振摇，混匀，取后分别加入20%NaOH溶液23滴，观察各试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。表16操作表醋酸铅反应1、实验原理多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和
9、胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。2、操作向试管中加入10%Pb(Ac)2溶液约1ml，再慢慢滴加10%NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加鸡蛋清23滴，混匀，小心加热，至溶液变黑后，小心加入浓盐酸数滴，黑色褪去，嗅其味，并将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。表17操作表实验一蛋白质的含量测定-双缩脲法一实验目的：掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理及方法。二实验原理1.双缩脲反应:在碱性溶液中，双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)与CuSO4作用形成紫红色的络合物，在5
10、40nm处有最大吸收，这一反应称为“双缩脲反应”。凡具有两个或两个以上的肽键(-CO-NH-)的化合物都呈双缩脲反应。蛋白质分子中因含有很多的肽键，故所有蛋白质都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，生成的颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此可用作蛋白质定量测定。由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分子肽链氨基酸残基的侧链功能关系较少。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。2.分类:常量法：测定蛋白质浓度范围：110mg/ml,选用540nm比色测定。微量法：选在310330nm检测，灵敏度比540nm检测高10倍。优点:利用双缩脲反应生成有色物质用作蛋白质的比色测定受蛋白质种类影响较小,是
11、优点之一。试剂和操作的简单、迅速也是其优点。缺点:灵敏度较差，仅适用于蛋白质浓度在0.5mg/ml以上的样品测定。Tris缓冲液、类脂、色素、一些氨基酸等会干扰此测定。3.本实验原理:本实验选用面粉作为测试样品，测定面粉中的蛋白质含量。三试剂和器材1测试样品：面粉。2试剂：标准蛋白质溶液：10mg/mL牛血淸白蛋白溶液。常量法的双缩脲试剂。/LNaOH溶液。3器材：分光光度计，电子分析天平，移液管(10mL2)，离心机。四实验操作1.标准曲线的绘制：用Excel绘制标准曲线及计算公式，如图：2.样品测定准确称取干面粉,置干燥三角瓶内，另取一个三角瓶作空白。按下表操作:样品手摇振荡2030分钟，各取8ml置离心管中，3500rp五结果计算：按下列公式计算出面粉的蛋白含量:y=+求解X六注意事项：(1).须于显色后30min内完成比色测定。七思考题：1.干扰双缩脲法测定的因素有哪些？S53/54紫外可见分光光度计独立使用说明S53分光光度计使用说明1.开机自检校正；2.至要键确认。3灯亮；4置入空白及样品;5调100%T；6灯亮；7调零；8拉杆读出数据。注意：不能在或灯亮时按“0%”键，否则会显示出错信息。在仪器使用登记本上登记。实验蛋白质的
