布鲁氏菌病实验研究与生物安全

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1、布鲁氏菌病实验研究及生物安全 Research Progress of Brucellosis in China and Control and Prevention,中国人间布鲁氏菌病疫情 1950-2014年,中国人间布鲁氏菌病空间分布变化,中国家畜布鲁氏菌病疫情,2014年中国布鲁氏菌病疫情分布,中国人间布鲁氏菌病疫情,2012/2013/2014年布病病例报告分析,Amsterdam, The Netherlands www.kit.nl,世界卫生组织建议的人布鲁氏菌病诊断,世卫组织建议的检测包括： 虎红平板试验(RBT) 血清凝集试验(SAT) Coombs试验 补体结合试验(CFT

2、) ELISA 荧光偏振 布氏菌培养 PCR 世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性） 没有明确的阳性和阴性预测值（PPV & NPV） 结论 取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化 PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立 建议 开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、PPV和NPV等）,WHO人布鲁氏菌病的诊断检测,IgM/IgG侧向层析检测 荧光偏振检测 虎红平板试验 血清凝集试验 2-ME 试验 IgM/IgG ELISA 库姆斯 (IgG) CFT 培养 （仅在BSL-3中） PCR,简易/快捷,复杂/要求高,灵

3、敏性 + + + + + + 参考 + + + +,特异性 + + + + + + + + 参考 + +,保健点,参比实验室,诊断机构,Amsterdam, The Netherlands www.kit.nl,虎红平板试验,检测特征（流行率低） 灵敏度 92.9 （急性病例） 特异性94.3% （无暴露史） 特异性91.7% （重复暴露） 特异性76.9 （既往布病患者） Ruis-Meza et al Clin Microbiol Infect. 2005;11(3):221-5,不同来源（品牌）和批次的抗原质量差异很大 难以解读（弱阳性） 由于暴露和非特异性反应，在疾病流行地区的表现不良

4、 需要确定取舍值 结论 诊断功效在很大程度上取决于制剂来源和疾病流行程度，需要确定取舍值,血清凝集检测,1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280,发现凝集抗体（IgM和IgG) 灵敏性随疾病持续时间下降 顽固性和布病复发患者中表现不佳 在本地流行地区/暴露个体中的特异性较低 流行地区的建议取舍值为1：320，提高特异性导致的低灵敏度 难以读取和标准化 2-ME检测可用于确诊急性病 (IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上）,布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢,布氏菌革兰染色,双相全血培养瓶 （已接种）,自动培养仪和培养瓶,

5、布氏菌生化鉴定,血平皿 布氏菌菌落,布氏琼脂布鲁氏菌菌落,布氏菌产生S2H试验,BCSP31-PCR,引物和扩增片段，产物223bp Primer1：B4 5-TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA-3 Primer2：B5 5-CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG-3 检测BCSP31基因的PCR方法，可以在属的水平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株 OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一,M DL2000 DNA Ladder 1。B. melitensis 2. B. abortus 3. B. suis 4. B. ovis 5. B. neotomae 6.B.

6、canis,M 1 2 3 4 5 6,布鲁氏菌属BCSP31-PCR电泳结果,-223bp,AMOS-PCR 鉴定布氏菌种,布鲁氏菌DNA多态性一个原因就是插入序列分布，IS711就是一段插入序列，在数量和位置上都很保守，一个引物锚定在IS711上，其他不同的引物分别选在与插入基因IS711邻近的单染色体DNA上，代表种的特异性，通过扩增带的大小来鉴别种。设计5条引物的混合反应体系，适用于布鲁氏菌种间的鉴定方法，可鉴别布氏菌牛种1，2，4型、羊种布鲁氏菌、猪种1型和绵羊附睾种。除了共有的178bp以外牛种布鲁氏菌1，2，4型扩增条带为498bp，羊种布鲁氏菌扩增片段为731bp，猪种1型扩增

7、条带为285bp，绵羊附睾种961bp。,19株标准菌株AMOS-PCR扩增结果,1、22.DL2000 DNA Ladder 2-4.B. Melitensis 1-3 5-11.B. Abortus 1 -7 12.B. Abortus 9 13-17.B. Suis .1 -5 18. B. ovis 19. B. neotomae 20. B. canis 21.阴性对照,750bp 500bp 250bp,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,250bp 223bp,布鲁氏菌属 种鉴定,1-5AMOS扩增 1、c- 2、羊1 3、牛1 4、猪1 5、待检菌株 6-10

8、BCSP31-PCR ：6、羊1 7、牛1 8、猪1 9、OVIS 10、待检菌株,多重PCR(Bruce ladder),Evaluation of a Multiplex PCR Assay (Bruce-ladder) for Molecular Typing of All Brucella Species, Including the Vaccine Strains,B. abortus,B. melitensis,B. suis,B. cains,布氏菌 MLVA 分型,中国分离株的基因型分布,生物安全,布氏菌在病原微生物的危害等级划分； 2类 属于高致病性 实验室适用等级分类：BS

9、L-3 其中弱毒株或疫苗株可在BSL-2实验室操作 小量标本，初代分离等可以在BSL-2实验室操作 血清学检测可以在BSL-1实验室操作,1、布鲁氏菌 强毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人体感染，感染所需菌量会有较大差别。 2 、实验活动与实验室级别要求 布病血清学实验可以在BSL-1实验室进行 未知标本分离菌、少量菌株实验、弱毒菌株的实验在BSL-2实验室进行 布氏菌的抗原制备、菌种保存在BSL-3,生物安全,注：,a大量活菌操作：实验操作涉及“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。 c样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实

10、验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。 d非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。,生物安全,病原微生物实验室感染分析 实验室获得性感染（laboratory-acquired infection） 由于没有监测、报告系统，数据资料不全 生物安全包括：实验室实践、实验室设计、个人防护措施和安全设备,生物安全,美国一份文件统计 实验室感染43%由细菌，27%由病毒，15%由立克次体 布氏菌是最常见的实验室获得性感染 最多的操作是：动物攻毒试验，冻干菌种，强毒株的大量抗原制备等,生物安全,感染途径 吸入、皮肤粘膜污染、摄入等 吸入感染 很多操作可产生气溶胶，

11、如：感染动物的皮毛、粪便，烧接种环、抽真空、离心、搅拌、研磨等 气溶胶5um液滴核会悬浮于空中， 皮肤粘膜污染：含病原体的液体溅在眼睛、口鼻粘膜及其他皮肤感染 摄入感染：误食和不洗手吃食物 接种感染,当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。,生物安全的评估,生物安全设备,生物安全柜 吸附垫：在操作台上放上贴有吸附材料的塑料薄膜，每日更换，可以把操作台

12、的污染减少到最低程度。 柜内实验器材和材料的取出 ：生物安全实验室的废弃的污染性材料、使用过的包装材料、容器、纸张等废弃物，都收装好或者经高压灭菌器灭菌后拿到缓冲区：实验中或完毕后，必须从安全柜中取出非灭活的病原体时，应装好放在消毒液槽中，使容器外侧被消毒后取出，消毒液种类因病原体不同而异。,生物安全设备,回收容器 ：在安全柜内配置回收污染物质的容器：配置存放污染的玻璃器皿和废弃物容器。容器中必须配有消毒液，将污染物质完全浸没。这些回收容器至少每天操作完毕后盖好以防污染。再次使用时需重新清配置消毒液。 瓶盖：安全柜内使用的瓶子不用橡胶塞，而用螺旋盖，开启时可减少气溶胶的发生。 消毒火焰：用火焰

13、消毒是经典的微生物学操作方法，但是由于会产生气溶胶，并顾虑使柜内气流紊乱，尽量不使用。,良好的内务行为,应指定专人监督保持良好内务的行为。工作区应时刻保持整洁有序。禁止在工作场所存放可能导致阻碍和绊倒危险的大量物品。 所有用于处理污染性材料的设备和工作表面在每班工作结束、有任何漏出或发生了其他污染时应使用适当的试剂清洁和消毒。 对漏出的样本或培养物应在风险评估后清除并对涉及区域去污染。清除时应使用有效的安全预防措施、安全方法和个人防护装备。,良好的内务行为,内务行为改变时应报告实验室负责人以确保避免发生无意识的风险或危险。 实验室行为、工作习惯或材料改变可能对内务和/或维护人员有潜在危险时，应报告实验室负责人，并书面告知内务和维护人员的管理者。 应制定在发生事故或漏出导致生物、化学性污染时，设备保养或修理之前对设备去污染、净化和消毒的专用规程。,离开微生物实验室前，脱掉工作服后，应进行手的清洗。离开生物安全2级和3级实验室时，脱防护服后再次用流水及肥皂冲洗手。 消毒可使用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂，如新洁尔灭醇、75%医用酒精或60%的异丙醇等35ml,擦于手指、手掌、手背揉搓13分钟。,良好的内务行为,谢谢大家!,