《第3章--细胞生物学研究方法(翟中和第四版)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第3章--细胞生物学研究方法(翟中和第四版)（99页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第3章 细胞生物学研究方法,本章主要内容,细胞形态结构的观察方法 细胞及其组分的分析方法 细胞培养与细胞工程 细胞及其生物大分子的动态变化 模式生物与功能基因组的研究,第一节 细胞形态结构的观察方法,病毒 20-200 nm 支原体 0.1-0.3 m 细菌 0.5-5.0 m 动植物细胞 20-30 m 活细胞多是无色透明的,直径,显微镜观察范围 肉眼观察范围,肉眼 0.2 mm 光学显微镜 0.2 m 电子显微镜 0.2 nm 扫描隧道显微镜 样品制备技术,分辨率,一、光学显微镜 (light microscope),从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重
2、要工具,1. 目镜 2. 准焦螺旋 3. 物镜 4. 载物台 5. 反光镜,（一）普通复式光学显微镜组成,由3 部分组成： 光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜） 镜架及调节系统,（一）普通复式光学显微镜成像,放大的倒立虚像 经物镜形成倒立实像 经目镜进一步放大成虚像,（一）普通复式光学显微镜分辨率,分辨率：显微镜最重要的性能参数 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离 普通光学显微镜最大分辨率0.2 m,: 光源波长 N : 介质折射率, 空气为1, 油为1.4 : 物镜镜口角(最大140o, Sin/2 最大0.94 ),镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。
3、,（一）普通复式光学显微镜样品制备,Figure 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察 A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加 B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差,体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相 差显微镜（B
4、）下拍摄图像效果的比较,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别 分辨率比普通光镜提高了一个数量级 录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程,Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),Four types of light microscopy,(A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light thro
5、ugh the cell, a technique known as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopy,Figure 9-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),正置显微镜与倒置显微镜比较,组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活
6、细胞，具有相差物镜。,（三）荧光显微镜基本原理,荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长),（三）荧光显微镜基本原理,光源和光学系统与普通光学显微镜不同 核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头 滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成,1.照明方式通常为落射式 2.光源为紫外光或其他短波 长的光 3.有两个特殊的滤光片 (发射滤片和阻断滤片),荧光显微镜光路系统,（三）荧光显微镜样品制备,免疫荧光技术 荧光素直接标记技术 绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达 两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位
7、,（三）荧光显微镜应用,在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具,荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分,（四）激光扫描共焦显微镜,以激光为光源 聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像 利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像 分辨率比普通荧光显微镜1.41.7 倍,（四）激光扫描共焦显微镜,可通过“光学 切片” 叠加后重构出样品的三维结构,Figure 9-20 Molecular Biol
8、ogy of the Cell ( Garland Science 2008),(二向的),3D Image Reconstruction,z,x,y,z,x,y,z,y,y,荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）,二、电子显微镜,透射电镜 transmission electron microscope, TEM,扫描电镜 scanning electron microscope, SEM,（一）透射电子显微镜,电子束作为光源 电磁透镜聚焦 镜筒高度真空 图像通过荧光屏或感光胶片记录,1电子显微镜与光学显微镜的基本区别,Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecula
9、r Biology of the Cell ( Garland Science 2008),光镜 电镜 光源 可见光（300-700nm）电子束 紫外光（200nm） 分辨率 200nm 0.2nm 透镜 玻璃透镜 磁透镜 真空 无要求 1.33*10-310-5Pa,电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50100千伏时，电子束波长约为0.00530.0037纳米,2电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数,电子显微镜分辨率可达0.2 nm 电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率,3电子显微镜的基本构造,电子束照明系统 成像系统 真空系统 记录系统,（二）透射电镜制样技术超薄切片技术,超薄
10、切片,黑白图像,超薄切片技术显示的细胞超微结构,应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构,Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),（二）透射电镜制样技术负染色技术,观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等 重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染） 分辨率可达1.5 nm 左右,（二）透射电镜制样技术冷冻蚀刻技术,包括冰冻断裂与蚀刻复型两步 观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感 样品不需固定包埋,冰冻蚀刻电镜照片,透射电镜照片与冰冻断裂 和冰冻蚀刻电镜照
11、片比较,电镜三维重构与低温电镜技术,电镜三维重构技术 低温电镜技术 电子扫描断层成像技术,核孔复合物,（三）扫描电镜技术,利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌,（三）扫描电镜技术,样品利用CO2 临界点干燥法处理 样品观察前喷镀一层金膜 一般扫描电镜的分辨本领仅为3 nm,Figure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较,注意样品制备技术的差异！,三、扫描隧道显微镜,探测微观世界物质表面
12、形貌 利用量子力学中的隧道效应 具有原子尺度的高分辨本领 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作 非破坏性测量,http:/en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png,第二节 细胞及其组分的分析方法,一、用超离心技术分离细胞组分,差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开,差速离心,一、用超离心技术分离细胞组分,密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带,二、细胞成分的细胞化学显示方法,显色剂与
13、细胞组分中特殊基团的结合 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量,福尔根反应 Feulgen stain,特异显示细胞内呈紫红色的DNA 的分布 原理：酸水解可以去除RNA，仅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使 脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂 （Schiffs reagent）反应呈紫红色,三、特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异蛋白的显示可通过抗原抗体特异结合的方法得以实现 若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察 为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)
14、，用电镜观察,（一）免疫荧光技术,直接间接免疫荧光技术（A） 间接免疫荧光技术（B）,（二）免疫电镜技术,在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位 免疫胶体金技术受到越来越多的青睐,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置,原位杂交技术,光镜水平 同位素标记或荧光素标记的探针 电镜水平 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合,FISH (Fluorescent In Situ Hybridization),五、定量细胞化学分析与细胞分选技术,流式细胞术,流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或
15、分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。,http:/ 1.分析细胞中DNA, RNA 含量和细胞表面分子含量 2. 细胞、细胞组分的分选,第三节 细胞培养与细胞工程,http:/ 细胞系：有限细胞系和连续细胞系 细胞株： 基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞 贴壁培养和悬浮培养,动物细胞培养,原代细胞 110代以内的细胞 传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞 接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂 生长的现象 细胞系 （Cell line) 极少数细胞在传10代后可渡过危 机而传下去40-50代次并仍保持原来的染色体的二 倍体数量及接触抑制行为 有限细胞系 永生细胞系：细胞发生了遗传改变(染色体明显改 变)，有癌变特点 细胞株（Cell strain) 单个细胞增殖而来，所有细胞具有相
