现代生物技术-05.酶工程

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1、生物技术概论 第五章：酶 工 程 Enzyme Engineering,四大生物工程,基因工程,酶工程,细胞工程,发酵工程,产物,产品,产品,一、酶的概念,1、酶(enzyme)是催化剂(catalyst) 所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。 酶在化学反应中就是充当这样的角色。,酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。,2、酶是一种特殊的生物催化剂 酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。其具有

2、催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。 （1） 酶具有催化的高效性 酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反 应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出1071012倍。,（2） 酶具有催化的高度专一性(specificity) 酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。 酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。 b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生

3、反应。如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。,c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。如：延胡索酸（反丁烯二酸）酶只专一催化于L-苹果酸和反丁烯二酸，兼具立体异构与顺反异构专一性。,（3） 酶的化学本质是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质，主要从以下几个方面来认识：a. 酶的化学本质是蛋白质的依据 . 酶与蛋白质一样是高分子胶体物质，且为两性电解质。 . 导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线以及其他蛋白变性剂，也能使酶失活 . 酶也能被蛋白水解酶水解而失去活性。 . 对高纯化的酶进行组成分析，表明

4、其或者是单纯蛋白，或者是蛋白质与其他小分子物质构成的络合物（即结合蛋白）。 . 根据核酸酶（RNase）的一级结构，人们已经从氨基酸开始，人工合成了具有催化活性的蛋白质产物。 b. 结合有辅助因子的酶中，蛋白质是其高效和高度专一催化特性的主导因素c. RNA性质的生物催化剂的发现，并未否定“酶的化学本质是蛋白质”的结论,综上，对于酶，可以有如下概念：酶是一种由生物体产生的，具有高效和高度专一催化活性的，与生命活动密切相关的蛋白质性质的生物催化剂。,二、酶的分类与命名,1酶的分类 酶的种类很多，目前发现的酶约有3700多种，为了更好地研究酶、应用酶，国际酶学委员会推荐了酶的分类系统，该系统根据酶

5、的催化作用类型，将已知酶为六大类： （1）氧化还原酶类（Oxidoreductases） （2）转移酶类（Transferases） （3）水解酶类（Hydrolases） （4）裂合酶类（Lyases） （5）异构酶类（Isomerases） （6）合成酶类（Ligases或Synthetases）,2、酶的命名 酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。,系统名：包括所有底物的名称和反应类型。,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。,乳酸：NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反

6、应类型。,3酶的标码为了更简便清楚地识别每一种酶，国际酶学委员会对每一个酶都用4个数字进行编码，称为酶的标码。如：醇脱氢酶，标码为 EC 1.1.1.1 已糖激酶，标码是 EC 2.7.1.1其中EC代表酶委员会系统（Enzyme Commission），前三个数字分别表示酶所属的大类、亚类 、亚亚类，根据这三个数字，可以判断出酶的催化类型和性质。第四个数字表示该酶在亚亚类中占有的位置，有了这四个数字，就可确定具体的酶。,酶的标码,三、 酶的活力测定,1酶活力的含义酶活力是指在一定条件下，酶所催化的化学反应进行的速度。反应速度越大，意味着酶活力越高。 2酶的活力测定测定酶活力，就是测定酶所反应

7、的速度，并且是初速度。 （1）酶反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的增加量。V -ds/dt dp/dt,(2) 测定方法：酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便，准确。酶活力测定主要包括两个阶段: 其一，酶与其作用底物反应一段时间；其二，测定反应液中底物或产物变化的量。,酶活力测定的一般步骤：a. 根据酶的专一性，选择适宜的酶反应底物。b. 根据资料或试验结果，确定酶促反应条件。c. 在适宜条件下，进行酶反应，记下反应时间。d. 反应一定时间后，终止反应，立即测定产物的生成量或底物的减少量。,终止酶反应的方法有： 反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；

8、立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活； 加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应； 将取出的反应液立即置于冰粒堆中，或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至o以下等等。,测定反应液中物质变化量的方法： 光学检测法： 如：用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸(NPP)水解生成的对硝基酚的量。 化学检测法： 如：用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量。,3酶活力单位酶活力的大小，可以酶活力单位表示。 （1） 1961国际酶学委员会规定：在25OC,各种最适条件下，一分钟内转化一个微摩尔底物所需的酶量为一个国际酶活单位（IU）。 （2）1

9、972年，EC又推荐了一个新的酶活国际单位katal，符号为kat。1个kat单位定义为：在最适条件下，每秒钟能使1摩尔底物转换的酶量，有kat、nkat、pkat 等单位。1 kat=1mol/s=60mol/min=60106mol/min =6107IU1IU=1mol/min=1/60 mol/s=1/60 kat=16.67nkat,四、酶工程的基本概念,1. 定义酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。,2. 内容酶工程研究的主要内容包括：酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶的分子修饰、酶和细胞的固定化、酶反应动力学和反应器、酶的应用等方面内容。,3. 任务酶工程的任务是：通过预先设计，经过

10、人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。,4、酶工程的种类 酶工程主要分为化学酶工程和生物酶工程两类 a. 化学酶工程又为初级酶工程，是酶学理论与化学工程技术相结合的产物。化学酶工程研究的主要内容： （1）酶的制备工艺 （2）酶和细胞的固定化技术（3）酶分子化学修饰 （4）人工酶的合成（5）酶反应器、酶传感器 （6）酶的应用等。,b. 生物酶工程 是在化学酶工程基础上发展起来的，以酶学理论和以DNA重组 技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，又称为高级酶 工程（advanced enzyme engineering）。生物酶工程研 究的主要内容： （1）克隆

11、酶的生产：即用DNA重组技术，大量生产酶。 （2）突变酶的生产：即用蛋白质工程技术，定点改变酶结构基因，生产性能稳定，活性更 高的酶。 （3）新酶的生产：即用蛋白质工程技术，设计新的酶结构基因，生产自然界中从未有过的性能稳定、活性更高的酶。,克隆酶的生产 例1：用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因，从人细胞转移到大肠杆菌细胞内，可以使大肠杆菌细胞生产尿激酶原。尿激酶酶原和尿激酶都是治疗血栓病的有效药物。突变酶的生产例2：酪氨酰-tRNA合成酶的突变酶，其为Ala 51取代了Thr 51，从而使该酶对底物ATP 的亲和活力提高了 100倍。,现代酶学研究主要沿着两个方向发展 （1）酶的分子生物

12、学方向：其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系；酶催化机制和调节机制；酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水平上进行酶的调节控制。 （2）酶工程方向：其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。,五、 酶的发现及研究历史,人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也,酶 酒,西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到18

13、97年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。 1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。,1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究， 1930年，证实酶是一种蛋白质；80年代初发现了具有催化功能的RNA核酶，这一发现开辟了酶学研究的新领域， 现已鉴定出40

14、00多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。,1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。 1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。 1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。 此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。,六、酶的应用历史,1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。 50年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转

15、向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。 50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。 60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。,1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。 1973年,千叶一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产-淀粉酶研究

16、成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期. 80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。,在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。 60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变; 70年代,修饰剂的选用、修饰方法上有了新的发展。 此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究 ,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。,5.1 酶的发酵生产,酶的生产方法酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需的酶的过程。酶的生产方法可分为： 一、提取法二、发酵法三、化学合成法,一、提取法 1. 提取法的含义：采用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来。 2. 实例：从动物胰脏中提取胰蛋白酶；从动物胃中提取胃蛋白酶；从木瓜中提取木瓜蛋白酶等 3. 提取法的特点：提取法是最早采用的一种酶的生产方法，该法直接、简便易行，尤其适合动、植物资源丰富的地区。但动植物生长周期长，易受气候、地理环境的影响，不适于大规模工业化生产。且产品杂质较多，分离纯化困难。,