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1、食品中致病性球菌的检验,一、金黄色葡萄球菌的检验葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品（剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物寄生菌，也有一些致病的球菌。食品中生长有金黄色葡萄球菌，是食品卫生的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食后能引起食物中毒。因此，检查食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。,（一）形态与染色典型的葡萄球菌呈球形，直径0.4m-1.2m，致病性葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个菌体的大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列。在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排列，易误认为链
2、球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色，G+，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转为革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株也为革兰氏阴性。,(二)分类葡萄球菌属于微球菌的葡萄球菌属，葡萄球菌种类繁多，以往的分类方法是以菌落色素将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌三种。但是这种色素指标很不稳定。,根据伯杰氏鉴定细菌学手册第八版，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病性菌，表皮葡萄球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般为非致病菌。,60-70的金黄色葡萄球菌可被相应的噬菌体裂解，故可用噬菌体进行
3、分型。表皮葡萄球菌对噬菌体不敏感，故不能用噬菌体分型。噬菌体分型在传染源追踪上具有重要意义。,通常使用的基本分型噬菌体有22型，根据它们对菌株的裂解反应，可将金黄色葡萄球菌分成以下几群： I群：29、25、52A、79、80； II群：3A、3B、3C、55、71； III群：6、7、42E、47、53、54、75、77、83A； IV群：42D。,金黄色葡萄球菌形态,金葡在Baird-Parker平板上菌落直径2-3mm，灰色到黑色，边缘淡色，周围有一浑浊带，外层有一透明圈。接种针接触有奶油至树脂硬度。偶见非脂肪溶解的类似菌落耽误浑浊带和透明圈。,触媒实验,电镜下的金葡,海博显色培基,可产生
4、不同色素，如金黄色、白色及柠檬色，这些色素为脂溶性，能溶于醇、乙醚、氯仿及苯等有机溶剂中，因不溶于水，故色素只限于培养物，而不外渗至培养基中。色素的形成依培养条件而异：通常在22产生色素较多；于37培养后，再置室温1d-2d，色素产生明显；在固体培养基中含有碳水化合物、牛乳或血清等，色素形成最好，有O2及CO2环境下易形成色素，而在无O2环境中不形成色素。,耐盐性强，在含5-10的氯化钠培养基中能生长，在含有20-30二氧化碳的环境中培养，可产生大量的毒素。,在肉汤培养基中生长迅速，3724h培养后，呈均匀混浊生长，延长培养时间，管底出现少量沉淀，轻轻振摇，沉淀物上升，旋即消散，培养2d-3d
5、后可形成很薄的菌环，在管底则形成多量粘稠沉淀。,在血琼脂平板上，形成的菌落较大，多数致病性菌株可产生溶血毒素，使菌落周围产生透明的溶血圈( 溶血)。,(四)生化特性本属细菌大多数不能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖。产酸不产气。致病菌株能分解甘露醇，产酸。甲基红阳性，VP为弱阳性，多数菌株能分解尿素产氨，还原硝酸盐，不产生吲哚。,(五)毒素与酶葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素和酶的能力。 溶血毒素、杀白血球毒素、肠毒素、 血浆凝固酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶,1、溶血毒素多数致病菌株能产生该毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。溶血毒素是一种外毒素，根据
6、其对动物细胞的溶血范围、抗原性、溶血时所需温度等不同可分为、四种，其中以溶血素为主。,2、杀白血球毒素能破坏人或兔的白细胞和巨噬细胞，使其失去活性，最后膨胀破裂。致病性与非致病性葡萄球菌都能被吞噬细胞吞噬，非致病性菌株在白细胞内很快被杀死，而致病菌株则能在白细胞内生长繁殖。,3、肠毒素金黄色葡萄球菌的某些菌株能产生引起急性肠胃炎的肠毒素。肠毒素共分6型(A、B、C1C 2、D、E)，各型具有不同的血清学特性，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。该毒素为一种可溶性蛋白质，耐热，经l00煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。可使人、猫、猴引起急性胃肠炎症状。,4、血浆凝固酶这是一
7、种能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的兔或人血浆发生凝固的酶。大多数致病性葡萄球菌产生此酶，而非致病性菌一般不产生。因此，凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。凝固酶较耐热，在l0030min或高压消毒后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破坏。,5、溶纤维蛋白酶可使人、犬、豚鼠及家兔的已经凝固的纤维蛋白溶解。溶纤维蛋白酶是一种激酶，可激活血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶而使纤维蛋白溶解。凝固酶及溶纤维蛋白酶可在含有血浆的琼脂平板内同时测定。初次培养后，菌落周围若出现一个不透明圈，表示产生凝固酶，继续培养时，不透明圈消失，说明为溶纤维蛋白酶作用的结果。,6、透明质酸酶透明质酸具有高度的粘稠性，是机体结缔组
8、织中基质的主要成分。它被透明质酸酶水解后，结缔组织细胞间失去粘性呈疏松状态，有利于细菌和毒素在机体内扩散，因此透明质酸酶又称为扩散因子。,7、脱氧核糖核酸酶 脱氧核糖核酸能够增加组织渗出物的粘性。当组织细胞及白血球崩解时释放出核酸，使组织渗出液的粘性增加，而脱氧核糖核酸酶能迅速分解之，从而有利于细菌在组织中的扩散。有人认为脱氧核糖核酸酶是鉴定葡萄球菌毒力的又一指标。,(六)抗原结构葡萄球菌经水解后，用沉淀法分析，可得到两种抗原成分： 蛋白质抗原 多糖类抗原,1蛋白质抗原主要为葡萄球菌A蛋白(SPA)，为金黄色葡萄球菌的一种表面抗原，存在于细菌细胞壁的表面，90以上的金黄色葡萄球菌有此抗原。SP
9、A能抑制吞噬细胞的吞噬作用，对T、B细胞是良好的促分裂原。,2、多糖类抗原为半抗原，存在于细胞壁上，是金黄色葡萄球菌的一种重要抗原，具有型特异性。其抗原决定簇为磷壁酸的核糖醇单位。此抗原可用于葡萄球菌的分型。,(七)抵抗力葡萄球菌抵抗力较强，为不形成芽胞的细菌中最强者。,在干燥的脓汁或血液中可存活数月。加热80 30min才能杀死，煮沸可迅速使它死亡。在5石炭酸、0.1升汞中10min-15min死亡。对某些染料较敏感，1100000-1200000稀释的龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺类药物的敏感较低，对青霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感。,(八)葡萄球菌的致病性葡萄球菌能引起的疾患主要有化脓性
10、感染（如毛囊炎、疖、痈、伤口化脓、气管炎、肺炎、中耳炎、脑膜炎、心包炎等)；全身感染(如败血症、脓毒血症等)；食物中毒等等。,金黄色葡萄球菌引起的须疮感染,葡萄球菌创口感染革兰氏染色涂片,据调查，由于葡萄球菌在自然界的广泛分布。 当金黄色葡萄球菌感染患者的鼻腔时，其带菌率高达83. 5； 接触奶类的饲养员，冷饮奶制品生产人员的带菌率为l6-20； 炊事员及熟食加工、糖果面包生产工人的带菌率为3.2-8.6。,鼻腔是葡萄球菌的繁殖场所，也是身体各部位的传染源。 葡萄球菌是常见的化脓性球菌之一，化脓部位常成为传染源。患乳房炎的奶牛产的奶、有化脓症的宰畜肉尸常带有致病性葡萄球菌。,葡萄球菌在不同食物
11、、不同温度和pH值的条件下，产生的肠毒素是不同的。 葡萄球菌在pH值低于5的条件下很少产生肠毒素，当pH值高于9.8时，无论何型葡萄球菌肠毒素都不能产生。,葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上，于20-37下经4h-8h产生毒素，在5-6低温下18d产生毒素或不产生毒素。 在含水分、蛋白质和淀粉较多的食品中，葡萄球菌较易繁殖并产生毒素。 如带菌的生肉馅，于37下经18h-19h产生毒素，若在肉馅中加入少量馒头碎屑，在同样温度下只经过8h就能产生毒素，可见淀粉对形成毒素有促进作用。,引起葡萄球菌肠毒素中毒的食品，主要为肉、奶、鱼、蛋类及其制品等动物性食品。 熟肉类如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20-30的
12、环境下放置较长时间，则极易引起中毒； 奶和奶制品以及用奶制作的冷饮（冰激凌、冰棍）和奶油糕点常是引起中毒的食品； 油煎鸡蛋、熏鱼、油浸鱼罐头等含油脂较多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能产生毒素。,葡萄球菌在空气中氧较低时较易产生肠毒素因此带有此菌的食品，在通风不良的高温下放置，极有利此菌生长并产生毒素。当食品污染了葡萄球菌并同时污染了其他微生物时，葡萄球菌的繁殖则受到抑制。如食品经加热，原有的各种微生物已被杀死，拮抗微生物也不复存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，则将会促进葡萄球菌的生长并形成毒素。,葡萄球菌引起的食物中毒在常发生于夏秋季节，这是因为气温较高，有利于细菌繁殖。但在冬季，如受到
13、污染的食品在温度较高的室内保存，葡萄球菌也可繁殖并产生毒素。,(九)发病机理葡萄球菌食物中毒，是由葡萄球菌在繁殖过程中分泌到菌细胞外的肠毒素引起的。A型肠毒素的毒力最强，摄入1g即能引起中毒，而B型肠毒素摄入25g才能引起中毒。,（十)检验原理金黄色葡萄球菌耐盐性强，在l00-150g/L的氯化钠培养基中能生长，适宜生长的盐浓度为5-7.5，可以利用这个特性对金黄色葡萄球菌增菌，抑制杂菌。,金黄色葡萄球菌可产生溶血素在血平板上生长，菌落周围有透明的溶血环。,可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱所以在Baird-Parker(含卵黄和亚碲酸钾)平板上生长，菌落为黑色，周围有一混
14、浊带，在其外层有一透明圈，利用此特性可分离金黄色葡萄球菌。,金黄色葡萄球菌还可产生凝固酶，凝固酶可使血浆中的血浆蛋白酶原变成血浆蛋白酶，使血浆凝固这是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标，是不是致病的金黄色葡萄球菌主要看它是否产生凝固酶。,（十一）检验程序 GB/T 4789.10-2010,GB/T 4789.10/382010 金黄色葡萄球菌检验,计数标准第一法：定性第二法：Baird Parker平板法 增加了计算公式第三法：MPN法,1. 定性,2. Baird Parker平板法,典型菌落计数和确认 1. 金黄色葡萄球菌在BP平板上，菌落致敬为2mm-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无浑浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 2.选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU-200CFU之间的平板，计数典型菌落数。 3.从典型菌落中任选5个菌落，做血浆凝固试验。,3. MPN法,检测流程,计数及血浆凝固酶实验,接种BHI肉汤及营养琼脂斜面,金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态,金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落,Thank you!,
