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1、1.2 基因工程的基本操作程序,2018/11/2,1,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区：,能转录，编码蛋白质,非编码区：,不编码蛋白质,能调控遗传信息表达,2018/11/2,2,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,与RNA聚合酶结合位点,编码区：,非编码区：,外显子：,内含子：,能编码蛋白质的序列,不能编码蛋白质的序列,2018/11/2,3,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,基
2、因的结构,2018/11/2,4,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,2018/11/2,5,山西省孝义市第二中学,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,2018/11/2,6,2018/11/2,7,目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,目的基因的获取,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一些具有调控作用
3、的因子,2018/11/2,8,获得目的基因的方法,从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？ 2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,基因的核苷酸序列等,利用PCR技术扩增目的基因 人工合成,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA,未知序列,基因较小已知序列,已知序列,2018/11/2,9,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性
4、末端,切口,DNA连接酶,相同,(二)基因表达载体的构建,2018/11/2,10,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）, 核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,2018/11/2,11,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入
5、终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,2018/11/2,12,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2018/11/2,13,(三)将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,2018/11/2,14,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管
6、通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,(三)将目的基因导入受体细胞,2018/11/2,15,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,2018/11/2,16,直接分离法:,用限制酶切成许多片断,2. 构建基因文库,将含有某种生物不同基因 的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,2018/11/2,17,直接分
7、离法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,分别与 载体连接,受体细胞,分别 导入,2. 构建基因文库,2018/11/2,18,mRNA 反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 双链DNA,反转录法：,2. 构建基因文库,2018/11/2,19,cDNA合成过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,2018/11/2,20,基因文库
8、的构建方法,2018/11/2,21,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列 基因的功能、基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因的表达产物蛋白质等特性。,3如何从基因文库中得到所需要的基因？,2018/11/2,22,利用PCR技术扩增目的基因,原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。,2018/11/2,23, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,选修1 P60,聚合酶链式反应,体外,特定D
9、NA片段,DNA双链复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,利用PCR技术扩增目的基因,2018/11/2,24,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,2018/11/2,25,2018/11/2,26,利用PCR技术扩增目的基因,2018/11/2,27,山西省孝义
10、市第二中学,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,2018/11/2,28,利用PCR技术扩增目的基因,2018/11/2,29,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因
11、。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,2018/11/2,30,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,2018/11/2,31,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA
12、可转移至受体细胞的染色体上,2.转化,2018/11/2,32,2018/11/2,33,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,2018/11/2,34,将目的基因导入受体的方法,2018/11/2,35,目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,2018/11/2,36,寻根问底 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中
13、获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,2018/11/2,37,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此
14、法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,2018/11/2,38,思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,2018/11/2,39,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控
15、元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2018/11/2,40,思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,2018/11/2,41,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,
