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1、实验七 DNA 指纹的遗传分析【实验原理】 “DNA 指纹”是指利用 DNA 差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以 DNA 的多态性为基础，而卫星 DNA 的发现则是其最重要的奠基石。 卫星 DNA 是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星 DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星 DNA 的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类 1 号染色体上的
2、VNTR D1S80，核心序列由16 个核苷酸组成，拷贝数在 1441 个之间，已知有 29 种不同的等位基因。DNA 指纹图谱的基本特点： 多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。 高变异性：DNA 指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同 DNA 指纹图谱的概率仅为 510-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的 DNA 指纹图谱完全相同。 稳定的遗传性：DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规
3、律。子代 DNA 指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.0010.004 之间。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的 DNA 作出的 DNA 指纹图谱是一致的。【材料】人类口腔细胞。【仪器与试剂】1 仪器微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR 仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪） 。枪头，1.5mL，0.2 mL 离心管，棉签，使用前均需 121高温灭菌2试剂NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA
4、 相对分子质量标记，Chelex 100 树脂（Bio-Rad ） ，PCR pre-mix。3溶液配制（1）5% Chelex 树脂Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g50mmol/L Tris-HCl 10mL用 4mol/L NaOH 调 pH 至 11，室温可保存 3 个月，使用前充分混匀。（2）2.0琼脂糖凝胶称 2.0g 琼脂糖放入 250ml 三角烧瓶，加 入 1TAE 溶液 100mL 微波炉加热溶解，冷却至 60左右加入 1g/mL 溴化乙锭（EB ） ，缓慢混匀后倒胶板。（3）溴化乙锭（EB）用无菌水配制 5mg/mL 储藏液，工作浓度 1g/mL。注意；溴化乙
5、锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0)Na2-EDTA 18.61gNaOH 2g蒸馏水定容至 100mL，室温保存。（5）10TAE 电泳缓冲液Tris 48.4g冰醋酸 11.42mL0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL蒸馏水定容至 1000mL，室温保存。（6）10%SDSSDS 10g 用无菌水溶解后（可加热） ，定容至 100mL，室温保存。（7）蛋白酶 K 溶液20mg/mL 蛋白酶 K 水溶液 5mL10%SDS 1mL无菌水 94mL冰箱冷藏。（8）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。（9）1mol/L
6、 Tris-HCl(pH8.0)将 12.1g Tris 溶解在 80mL 蒸馏水中，加盐酸调节 pH 至 8.0，加蒸馏水定容至100mL。4引物Primer1：5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3Primer2：5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3【实验步骤】1收集 DNA 样本（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入 1.5mL 装有 1mL 无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好） 。震荡10s，10000 r/min 离心 1min。（2）从离心管中吸出 970L 无菌水
7、，注意不要吸到沉淀。（3）向离心管中加入 200L 5% Chelex 100，震荡 10s 混匀。（4）加入 2L 蛋白酶 K，混匀， 56保温 5min。（5）剧烈震荡 10s,沸水浴 8min。（6）10000r/min 离心 3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为 Chelex100 和细胞碎片的沉淀，上层溶液含 DNA 分子，可以直接用作 PCR 模板。此 DNA 样本可在 4或-20保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。2PCR 扩增 D1S80 等位基因（1）每个人用记号笔在 0.2mL PCR 管上做好标记。（2）准备冰盒，开始反应前尽量使 PCR 管保持在
8、冰上。（3）依次加入下列成分，配制 25L 体系的 PCR 反应溶液：PCR pre-mix 12.5L引物 1 1L引物 2 1L口腔细胞 DNA 样本 10L 加无菌水至总体积 25uL。（4）轻弹管壁，混匀溶液。（5）离心 10s，使管壁上的液滴落下。（6）按下列程序开始 PCR 反应：94，1min94，15s68，15s72，15 s30 个循环72，10min4暂时放置，直至开始电泳3PCR 扩增产物鉴定与 D1S80 等位基因分析（1）用 1TAE 电泳缓冲液配制 2.0%琼脂糖电泳凝胶。（2）60V 预电泳 12min。（3）在凝胶上选一孔加入 6L 的 DNA 相对分子质量标
9、记（DNA100bp Ladder） 。（4）每位同学将各自的 20LD1S80 PCR 扩增产物加入指定凝胶样孔，注意不要有气泡进入。（5）60V 电泳 40min-50min。（6）取出凝胶用清水漂洗。（7）用紫外分析仪观察凝胶，记录每个个体的 DNA 条带数目及其位置。【结果与分析】本次实验所选择的方法是 D1S80 指纹图谱分析的常用方法。人群中 D1S80 座位的杂合率约为 86。从理论上讲，可能存在 435 种不同的等位基因组合。利用 D1S80 座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990） ，通过 PCR 反应，很容易确定特定个体的 D1S80等位基因构成，纯合体只
10、有一条 DNA 带，而杂合体有两条不同的 DNA 带。1 将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp） 。（见附图）2 根据电泳结果，填写 D1S80 等位基因分析结果（表 7-1）：D1S80 DNA 指纹特征学生姓名 大小/bp 长度（重复数） 杂合/ 纯合小组成员 A 460 19.688 杂合小组成员 A 380 14.688 杂合小组成员 D 590 27.812 杂合小组成员 D 480 20.938 杂合表 7-1 结果记录表注：因为重复数为 l 的 DIS80 PCR 产物长 161bp，所以，重复数每增加一个
11、，序列增加长度 16 bp。据此可以催算：重复数=1+（PCR 产物大小161 ）/163在班级中调查有无同学 D1S80 指纹图谱完全相同或部分相同。自行查找有关人群中D1S80 各等位基因频率的资料，计算两个没有亲缘关系的个体，其 D1S80 指纹图谱完全相同或部分相同的概率。从各小组的电泳紫外图谱看，有一些同学的 DNA 指纹图谱看起来有些相似，但鉴于本次实验误差大，难以确定其指纹图谱是相同的。理论上可能存在 435 种不同的等位基因组合。那么 D1S80 指纹图谱完全相同的概率应为 1/(435*435)=1/189221.【讨论】从图电泳图可以看出，只有 A、D 两小组成员的条带清晰明显。小组成员 E 的 PCR产物聚集在加样孔中没有迁移，可能是因为其产物不存导致的；其他成员均没有条带或很浅，可能是由于收集的 DNA 样本过少，未能 PCR 出足够的扩增产物。【思考题】用 PCR、RFLP、RAPD 方法产生 DNA 指纹图谱各有哪些利弊？答：RFLP 分析对样品纯度要求较高，样品用量大，步骤繁琐、工作量大、成本较高；RADP 图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；
