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1、定点单突变及多突变,随着分子生物学研究的突飞猛进,基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段,在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。目前, PCR介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法,以PCR为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变,且可以在侧引物的两端设计酶切位点,方便进一步的连接克隆。我今天要举得例子是重叠延伸突变，包括两个内容：一定点单突变。二.定点多突变。,一：定点单突变,1 材料和方法
2、 1.1.材料：Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶Mlu和Bgl及琼脂糖。2个含有突变碱基的反向互补的引物，2个分别与DNA两端互补的上下游通用引物： 引物1:5GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3， 引物2: 5GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3， 引物3: 5 ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3 ， 引物4:5GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3，,1.2.方法： 2. 1 正常人TGF -2基因- 270bp + 280bp启动子区 报告基因的构建。
3、1. 2. 2 人TGF -2基因启动子区突变体基因的构建。,整个诱变过程需要两次PCR，第一次PCR进行两个反应，分别得到5 端和3 端重叠的两个DNA 片段。两个PCR反应的产物混合变性、复性，含有重叠部分DNA片段可以配对，在DNA聚合酶的作用下延伸，产生完整的双链。用上下游通用引物进行第二次PCR，扩增含突变位点的完DNA。操作过程如图11所示。,第一次pcr：分别利用两对引物进行常规pcr，产生两个DNA片段。两个pcr片段有一段的重叠，即互补配对，且突变位点位于重叠序列中间位置，进行跑胶。第二次pcr：纯化回收后，两个片段混合作为模板分别利用引物1和引物2 进行pcr，变性后的两个
4、片段将在重叠区域退火,进而延伸形成全长。进行跑胶。,1.3.克隆及测序：反应结束后,将PCR 产物进行回收,经酶切、连接、转化等步骤后克隆到pGL3 - Basic报告基因载体中,送上海生物工程公司测序。看单位点突变是否成功。,结果： 重叠延伸PCR扩增人TGF -2基因启动子区-114bp区突变基因 和分别为5端带有突变位点的短片段PCR产物, 是以和为模板进行延伸并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物,见图1。,2.定点多突变：下面举一个双突变的例子：与单突变不同，双突变需要六个引物，两个通用引物，以及四个定点突变引物：方法看图2.,结果：,图2 各阶段PCR产物电泳图,M:DL2000 DNA 分子量标记; 1: 985bp 片段; 2: 578bp 片段; 3: uORF1Mu (由985bp 片段、578bp 片段重叠延伸而来,长 1534bp) ; 4: 1101bp 片段; 5: 459bp 片段; 6: uORF2Mu (由1101bp 片段、459bp片段重叠延伸而来,长1534bp),
