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1、生物技术在天然药物研究中的应用,马建苹,Tel: 0931-2976699 (O) E-mail:,绪论,一天然药物生物转化基本概念生物转化技术:应用植物细胞培养体系、微生物或酶等生物体系对外源化合物进行合成和结构修饰。天然药物生物转化：利用生物转化技术对天然活性化合物进行合成和结构修饰。,喜树碱,人参皂苷Rh2,紫杉醇,二天然药物生物转化的发展 第一阶段：植物组织和细胞培养,罗汉果,怀地黄,人参,第二阶段：悬浮细胞培养,紫草,红豆杉,黄芪,三天然药物生物转化的特点1.专一性强 2.副产物少、产量高 3.反应条件温和 常温 常压 pH近中性 4.可以进行化学方法难以进行的反应,第三阶段：微生物
2、、酶转化技术的应用,泼尼松,四生物转化在天然药物研究中的应用 1.为天然药物的生产提供有效途径 2.为天然药物的结构修饰与设计提供新的工具 3.结合药物筛选,为新药开发提供了研究手段 4.提高天然活性成分的生物利用度 5.成为中药制剂中除去大分子杂质的有效方法,天然药物的微生物转化,一微生物转化的应用微生物转化:通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰,也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。特点:生物量积累快转化时间短转化酶表达效率高便于工业化生产,（一）在有机合成领域的应用应用于微生物转化的酶：乙酰转移酶、糖苷酶、糖基转移酶、环氧酶、羟基化酶、
3、醛缩酶等。六大类：氧化还原酶类转移酶类水解酶类裂合酶类异构酶类合成酶（连接酶）类,优点：高度选择性（化学、区域、非对映体、对映体选择性）反应条件温和酶种类多样酶量充足转化效率高产品质量稳定对环境污染少 缺点：酶易失活（pH、温度和高盐浓度）产物和底物的抑制现象,1.手性化合物合成与拆分“反应停”（沙利度安）事件R-对映体 镇静作用S-对映体 致畸作用手性化技术：色谱法化学不对称合成法生物合成与拆分法,三种手性化技术方法的比较,生物合成手性化合物： 外消旋体拆分为两个光活性对映体酶催化生成不对称的光活性产物实例： 消旋布洛芬酰胺,Rhodococcus AJ270,S-布洛芬,黑根酶, 90%,
4、2.食品添加剂的合成维生素C的合成,D-葡萄糖,H2/Ni,D-山梨醇,L-山梨糖,2-酮基-L-古龙酸,维生素C,乙酸杆菌,混合菌,烯醇化、内酯化,香草醛的合成,微生物-氧化,诺卡菌,（二）在新药开发中的应用新药合成：化学合成生物转化生物转化方法：天然活性成分（先导化合物） 结构新颖的化合物 发现关键活性成分,利用多种不同催化功能的酶系,（三）作为体外模型预测代谢药物代谢：研究药物分子在体内以不同的规模发生的生物化学转化相代谢functionalization：氧化、还原、水解相代谢conjugation：葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷光甘肽结合预测代谢的优点：可提供大量的筛选模型成本较低、操
5、作简单、易于控制调节优化条件，显著提高代谢产物收率，作为代谢产物的对照品进行药 理和毒理研究减少实验动物用量,二微生物转化方法,（一）微生物转化的反应,1.应用于氧化反应 （1）脱氢反应 细菌 （2）羟基化反应 放线菌 2.应用于水解反应 细菌、酵母菌和霉菌 3.应用于还原反应 酵母菌和霉菌 4.应用于酰基化反应 细菌 5.应用于降解反应 细菌 6.应用于脱水反应 细菌和霉菌,（二）微生物转化的一般过程,1.选择菌种 2.制备培养基 3.加转化底物 4.添加刺激剂或抑制剂 5.控制好转化反应培养时间 6.调控好影响因素 7.控制好转化反应终点 8.分离纯化转化产物,（三）几种常用的微生物转化方
6、法,1.分批培养转化法 2.利用酶进行生物转化 3.应用渗透细胞进行生物转化 4.应用孢子进行生物转化 5.应用固定化细胞进行生物转化 6.应用干燥细胞进行生物转化 7.静息细胞转化法,（四）微生物转化反应的特点,1.反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快 2.可以减少反应步骤 3.对立体结构合成上具有高度的专一性 4.回收率高、成本低,三微生物转化的影响因素,1.转化的时间和温度 2.底物添加方法 3.酶的抑制剂 4.酶的诱导剂 5.生长调节剂,四新技术在微生物转化中的应用,1.基因工程技术 2.固定化细胞转化技术 3.双水相转化技术 4.超声波技术 5.有机介质中的微生物转化 6.生物
7、反应器的应用 7.核磁共振、质谱技术,五天然药物的微生物转化结构修饰和改造 复杂结构天然产物 转化产生新的组合天 然化合物群 改变药物的功能疗效 定向合成 天然活性成分含量低 以微生物为反应器 定向合成,（一）喜树碱,喜树碱，20(S)-camptothecin， CPT,1966年美国化学家Wall和Wani从喜树Camptotheca acuminata Decne中分离得到具有较强抗肿瘤和抗病毒活性的生物碱成分不具有明显的生物碱性质近中性分子不溶于酸，与酸不成盐，难溶于水及一般有机溶剂可溶于吡啶、二甲基亚砜、乙酸和氯仿与甲醇的混合液，呈蓝色荧光对光、热敏感，光照射后，吸光度降低，避光稳定
8、，加热可使喜树碱分解,分子式 C20H16N2O4M 348.36熔点 258-263,拓扑特肯，Topotecan，TPT,依诺替康，Irinotecan，CPT-11,羟喜树碱,动物药理和临床试验证明，羟喜树碱有较好的治疗效果和较低的毒副反应1977年，国内通过鉴定，治疗肝癌、胃癌和白血病等 喜树碱及其衍生物对卵巢癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和白血病等恶性肿瘤均有一定的疗效1992年，TPT和CPT-11获美国FDA认证，是卵巢癌和结肠癌的特效抗肿瘤药物,羟喜树碱得率非常低，约为生药的十万分之二提取过程需用大量有毒的氯仿和甲醇利用含量较高的喜树碱（万分之七）生物转化,曲霉T-36,黄曲
9、霉T-419,20%,50%,（二）雷公藤内酯,中药雷公藤来源于卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.的根、叶及花产于福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州等地，主要分布在长江中下游地区临床上治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、麻风病、自身免疫性疾病、皮肤病,化学成分有生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、糖和木质素类雷公藤二萜属松香烷型二萜，多数具有,-不饱和内酯结构具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤等多种显著生理活性肾毒性大，限制了临床应用,雷公藤甲素的微生物转化,雷公藤甲素,5-羟基,19-羟基,19-羟基,16-羟基,雷公藤乙素,15-羟基,
10、1-羟基,Cunninghamella blakesleana,雷公藤内酯酮的微生物转化,Aspergillus niger,雷公藤内酯酮,雷公藤甲素,17-羟基,16-羟基,5-羟基,除19-位羟基化产物外，大多数转化产物表现出较强的体外细胞毒活性对BGC-823、Hela、HL-60、KB等人癌细胞株 IC50 10-8-10-7 M 均比底物有所降低,（三）鬼臼毒素,小檗科植物喜马拉雅鬼臼Podophyllum emodi和美洲鬼臼P. peltatum分离得到1946年King和Sullivan证实鬼臼树脂和鬼臼毒素对动物实验癌细胞有破坏作用副作用太大，影响临床应用50年代开始对鬼臼毒
11、素进行结构改造,鬼臼毒素，Podophyllotoxin,无色针状结晶分子式C22H22O8M 414熔点112-117溶于乙醇、氯仿、丙酮、热苯、冰醋酸,70年代出现2个半合成抗肿瘤药物,鬼臼乙叉苷，Etoposide，VP-16,鬼臼甲叉苷，Teniposide，VM-26,依托泊苷,特尼泊苷,1984和1992年，美国FDA批准依托泊苷和特尼泊苷上市全球市场份额达40-100亿美金两种抗癌药对淋巴肉瘤、膀胱癌、乳腺癌和儿童急性白血病有效,依托泊苷对小细胞肺癌、淋巴瘤疗效显著对卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞瘤也有效毒副作用大、生物利用率低和难溶于水,NPF,GL331,（四）蟾毒配基,蟾酥为两
12、栖纲无尾目蟾蜍科中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor和黑眶蟾蜍 Bufo melanostictus Schneider耳后腺和皮肤腺分泌物的干燥物复方和中成药配伍中具有重要地位 如“六神丸”和“症喉丸”西欧，17-18世纪用蟾皮干燥粉末治疗浮肿蟾酥主要有效成分为蟾毒配基类bufogenins化合物，具有很强的强心升压作用,蟾毒配基类化合物基本骨架,华蟾毒精、蟾毒灵和脂蟾毒配基的含量最高，三者约占药材干重10%具有强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤等生理活性对肿瘤细胞 IC50 1-100 nM 蟾毒灵活性尤为显著抗肿瘤的作用机制通过诱导细胞凋亡，促进细胞分化
13、,cinobufagin 华蟾毒精,bufalin 蟾毒灵,resibufogenin 脂蟾毒配基,华蟾毒精的微生物转化,Mucor，Alternaria，Syncephalastrum选择链格孢A. alternata AS3.4578制备转化,华蟾毒精,+,+,3-羰基-12-羟基,12-羟基,12-羟基-去乙酰,3-羰基-12-羟基,3-羰基-12-羟基-去乙酰,12-羰基,蟾毒灵的微生物转化,选择刺囊毛霉Mucor spinosus AS3.3450制备转化,蟾毒灵,1-羟基 15 -羟基 15-羟基 5-羟基 12-羟基,7-羟基,11-羟基,16-羟基,7,16-二羟基,1,7-二
14、羟基,1,12-二羟基,3-表-7-羟基,脂蟾毒配基的微生物转化,选择细孢毛霉Mucor subtilissimus AS3.2454制备转化,脂蟾毒配基,11-羟基,12-羟基,16-羟基,1,11-二羟基,1,12-二羟基,12,16-二羟基,12-O-D-葡萄糖苷,（五）大黄蒽醌类,蓼科掌叶大黄 Rheum palmatum L.唐古特大黄 R. tanguticum Maxim. Ex Reg.南大黄 R.officinale Baill.的根状茎产于四川、甘肃、青海、西藏、宁夏、陕西、湖北、云南、贵州等地生用或酒制、蒸熟、炒黑用功效：泻下、健胃、清热、解毒富含的大黄素、大黄酸、大黄酚
15、、大黄素甲醚、芦荟大黄素，具致泻和抗菌作用刺囊毛酶Mucor spinosus对大黄酚、大黄素甲醚、大黄素具有转化作用蓝色梨头酶3.3389可以使大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素糖苷化,大黄酚,大黄素甲醚,大黄素,Mucor spinosus 285天,Mucor spinosus 285天,Mucor spinosus 285天,Mucor spinosus 285天,（六）麻黄碱,又称麻黄素，l-麻黄碱和 d-伪麻黄碱是麻黄的主要活性成分麻黄碱属拟肾上腺激动药治疗支气管哮喘、各种咳嗽、过敏反应、低血压等症还具有松弛平滑肌、收缩血管、加速心率、升高血压及中枢神经兴奋作用伪麻黄碱为拟交感
16、神经药收缩上呼吸道黏膜血管作用 与麻黄碱相当升压作用 只及l-麻黄碱一半对心血管和中枢神经系统兴奋作用 明显弱于麻黄碱加快心率、升高血压、中枢兴奋等不良反应较轻有显著的利尿作用临床上治疗感冒如白加黑、新康泰克、银得菲、泰诺感冒片等治疗咳嗽如定喘宁胶囊、小儿止咳糖浆,生产方式植物提取法直接化学合成法半生物合成法微生物直接转化法 国内外报道很少,丙酮酸脱羧酶,CO2,L-麻黄碱,D-麻黄碱,（七）延胡索素,罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang块茎的化学成分延胡索性微温，味辛，能和血散瘀、行气止痛具有镇痛、镇静、安定及催眠作用对慢性持续性疼痛效果较好对创伤及手术后疼痛作用较差主要有延胡索甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、己素等延胡索乙素dl-tetrahydropalmatine, THP为优良的镇痛、镇静、催眠药物,
