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1、实验六 金黄色葡萄球菌的检验,广东科贸职业学院,2,Contents,生物学特性-菌体形态及培养特征,广东科贸职业学院,3,广东科贸职业学院,4,电镜照片,广东科贸职业学院,5,5、大多数菌株能生长在6.5-46之间（最适温度30-37）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.0-7.5）； 6、大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化,广东科贸职业学院,6,7、好氧生长的细胞产生接触酶； 8、产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，
2、水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸 9、所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。,广东科贸职业学院,7,致病性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；,广东科贸职业学院,8,c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关 d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，
3、可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌 e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。,广东科贸职业学院,9,致病性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,广东科贸职业学院,10,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可产生相当数量的肠毒素。
4、,广东科贸职业学院,11,1、目的要求,了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法 观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Baird-Parker琼脂平板上生长的菌落特征 观察金黄色葡萄球菌产生血浆凝固酶现象,广东科贸职业学院,12,2、基本原理,金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。 在血平板上生长可金黄色色素使菌落呈现金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈 在B-P平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一混浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。,金黄色葡萄球菌型溶血,金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态,广东
5、科贸职业学院,13,在肉汤中培养时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中，此酶类似凝血酶原物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成纤维蛋白，血浆因而成凝固状态,广东科贸职业学院,14,葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健
6、康是一种潜在危险 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。,广东科贸职业学院,15,肠毒素形成条件： 存放温度，在37C内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,广东科贸职业学院,16,实验材料,仪器材料：显微镜、恒温箱、无菌吸管、无菌试管、 无菌平皿、 载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等 培养基及试剂：10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Bai
7、rd-parker培养基、无菌盐水、BHI肉汤、兔血浆、革兰氏染色液,广东科贸职业学院,17,BP平板,主要成分及作用： 氯化锂、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生长丙酮酸钠: 促进葡萄球菌生长亚碲酸钾: 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄: 含蛋白质、卵磷、脂肪,广东科贸职业学院,18,检验程序,检验处理：取25g固体样品或吸取25ml液体样品，加入225ml灭菌生理盐水，固体制成混浊液,吸取5ml 上述混悬液，接种于50ml 7.5氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内，置361培养24h,转种血平板和B-P 平板，置361培养24h ，挑取血平板上金黄色（有时为白色
8、）菌落时行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验,血浆凝固酶试验：取新鲜兔血浆，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，置361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性。同时以已知阳性金黄色葡萄球菌株作为对照。,广东科贸职业学院,19,取2 5ml 样品，接种于225ml 7.5氯化钠肉汤培养基内，置361培养24h,转种血平板和B-P 平板，置361培养24h ，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落时行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验,血浆凝固酶试验：吸取1：4 新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h
9、的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，置361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。,检验程序,直接计数法,广东科贸职业学院,20,25 mL样品+ 225mL 7.5%氯化钠肉汤,血平板,36 1 24h,镜 检 营养肉汤,血浆凝固酶 实验,报告结果,定性 检测,36 1 24h,36 1 24h,36 1 6h,BP平板,广东科贸职业学院,21,25g样品+ 225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤,将有生长的管划线接种,36
10、 1 48h,镜 检 营养肉汤,血浆凝固酶 实验,报告结果 MPN/g(mL),定量 检测 （MPN法）,36 1 48h,36 1 24h,36 1 6h,适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌，却带有大量竞争菌的样品,梯度稀释,广东科贸职业学院,22,25g样品+ 225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的B-P平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36 1 48h,镜 检 营养肉汤,血浆凝固酶实验,报告结果 金葡菌数/g(mL),定量 检测 （平板法）,每种类型至少选取一个菌落,36 1 24h,36 1 6h
11、,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品,梯度稀释,广东科贸职业学院,23,形态：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.51um。 培养特征：在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在B-P平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻
12、或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,广东科贸职业学院,24,广东科贸职业学院,25,广东科贸职业学院,26,直接计数法,吸取上述1：10 混悬液，进行10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1ml，分别加入三块B-P 平板，每个平板接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml，然后用灭菌L 棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在361温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，361 24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法 菌落计
13、数：将三十平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。,广东科贸职业学院,27,结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检阳性，致病菌较非致病菌小，大小排列整齐。细菌繁殖时多呈多个平面的不规则分裂，堆挤成葡萄串状。在中毒食品、脓汁或液体培养基中常呈单个或环状球短链排列，易误认为是链球菌 血平板上菌落呈金黄色，周围有溶血圈。在B-P平板上呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。 致病性葡萄球菌血浆凝固酶为阳性,广东科贸职业学院,28,注意事项,样品中金黄色葡萄球菌计数进行10倍稀释时要注意，每个稀释度要更换吸管 实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验室材料高压灭菌后方可清洗或弃之。,广东科贸职业学院,29,思考题,金黄色葡萄球菌引起食物中毒的机理是什么？ 为什么要采用血浆凝固酶实验来决定葡萄球菌的致病和不致病？,广东科贸职业学院,30,金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上（1824h）,金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落形态,广东科贸职业学院,31,金黄色葡萄球菌凝固酶实验（玻片法）,金黄色葡萄球菌凝固酶实验（试管法）,Thank You !,
