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1、课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,多聚酶链式反应（简称PCR）：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。,美国科学家（穆利斯）发明的PCR技术，1993年诺贝尔奖 。,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,教学目标: 1、说明PCR的原理和条件。 2、理解PCR的反应过程。 3、掌握PCR的基本步骤。,温故而知新细胞内DNA复制的基础知识,使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,打开DNA双链,提供DNA复制的模板,合成子链的原料,催化合成DNA子链,DNA的平面结构几个要点注意：,5端,3端,3端,5端,DNA的羟基（
2、-OH）末端为3端; 磷酸基团的末端为5端,特性：不能从头开始，而只能从DNA的3端开始延伸DNA链。因此DNA复制需要引物。,DNA聚合酶,一小段DNA或RNA,3端,5端,5端,3端,DNA的合成方向：从子链的5端向3端延伸,母链,子链,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物与两条单链结合,一、PCR原理：,DNA分子热变性原理,DNA模板,4种脱氧核苷酸,需要，两种 （引物I和引物II）,不需要，控制温度（PCR仪器）,Taq DNA聚合酶（耐高温）,缓冲液,二、PCR的反应条件：,三、PCR的反应过程：,PCR一般
3、经历三十多次循环，每次循环可以分为：,复性,变性,延伸,当温度上升到90左右，双链DNA解旋为单链。,当温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。,当温度上升到72左右，游离的四种脱氧（A、T、C、G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,变性95oC,三、PCR的反应过程：,第一次循环,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,利用PCR技术扩增,循环特点：,上一次循环的产物为下一循环的模板； 结果单链中有最初母链的只两条（无引物） 存在于两个子代DNA分子中；
4、 其它子代DNA分子都为双引物分子式； 扩增的是两引物之间的DNA序列，其呈指数增长12N。,三、PCR的反应过程：,准备好PCR反应体系的配方,四、实验操作：,1、为了外源DNA等因素的污染，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； 2、PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。 3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。,五、操作提示：,课堂小结, ,血红素基因,课题3 血红蛋白的提取和分离,教学目标: 1、理解凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的原理和缓冲液的组成、作用。 2、体验血红蛋白的提取和分离过程。,蛋白质的分离
5、和提取的原理是什么？,思考：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同蛋白质。,是微小的多孔性球体（内部有许多贯穿的通道），如葡聚糖或琼脂糖。,也称“分配色谱法”，根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。,1、概念：,一、实验方法 （一）凝胶色谱法,2、材料：凝胶,3、原理：,原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢,洗脱,从色谱柱上端不断注入缓冲溶液，促使蛋白质分子的差速流动。,缓冲溶液（洗脱剂）,作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（模拟生
6、物体内的过程）,一、实验方法 （二）电泳法,1、概念：,2、原理：,3、常用：,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳,二、实验操作,洗涤目的： 洗涤干净：,去除杂蛋白,直至上清液没有黄色,加蒸馏水和甲苯,有机溶剂(无色透明的甲苯层),脂类物质(白色脂溶性
7、物质沉淀层),血红蛋白溶液(红色透明液体),红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀),目的：去除血红蛋白中的小分子杂质,二、实验操作,二、实验操作,凝胶色谱法,目的：除去血红蛋白中分子量较大的杂质蛋白质。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,纯化,二、实验操作,凝胶色谱法,目的：除去血红蛋白中分子量较大的杂质蛋白质。,纯化,二、实验操作,凝胶色谱法,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,1.调液面,2.加样3.再调液面,4.洗脱,5.收集,二、实验操作,纯化,凝胶色谱法,二、实验操作,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,二、操作提示,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,未能除去血浆蛋白的原因,会使白细胞等一同沉淀,血红蛋白的提取和分离,知识总结,导学案后面的习题答案,【专题五课题2】 18 DDCAB AAC 【专题五课题3】 18 BBBAD CBC,Thank you！Good Luck！,
