分子生物学常用技术pcr

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1、分子生物学常用技术,凝胶电泳,分子杂交技术,PCR 技术,DNA 物理图谱DNA序列测定 生物芯片,“基因靶向”技术,RNA干扰技术,PCR 内容包括:PCR 技术的发明 PCR 扩增产物的分析 PCR 技术基本原理 PCR 条件优化PCR 反应体系 PCR 技术的发展史PCR 反应条件 PCR 技术的应用 (请自学),PCR 技术,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 体外核酸扩增技术将目的基因或某一DNA片段于数小时内体外扩增至百万倍,千万倍。 PCR技术是生物医学领域: 革命性创举和里程碑。迅速渗透到各个领域: 分子克隆、 目的基础检测、基因诊断、

2、基因表达调控,、 法医学鉴定、食品卫生,、环境监测考古学等。,简便、特异、快速、灵敏、产率高、 重复性好、易自动化等可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定，用PCR几小时便可完成。DNA克隆重组, PCR, DNA序列分析构成了整个分子生物学实验工作的基础。,PCR 特点:,RT-PCR RAPD-PCRRandom Amplification of Polymorphic DNA. DDRT-PCR差异显示反转录PCR LAM-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE,Multiplex PC

3、R Anchored PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR Recombinant PCR SSCP In situ PCR Flow chip PCR,PCR相关技术层出不穷 请自学,(一): PCR技术的发明,1971年: Korana 设想本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。,1983年: Kary B. Mullis (1944 -)在Cetus公司工作期间， 他原本是要合成

4、DNA引物来进行测序工作， 常为没有足够多的模板DNA而烦恼。一天晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA 的想法.,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合DNA， ,1985年: Mullis PCR设想的实现原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供: 摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系、DNA变性、复性及延伸的温度与时间。Mullis使用是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段.缺点是：1): Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环

5、都要重新加。2): 特异性差: 引物链延伸反应在37下进行，模板和引物之间的碱基错配，合成的DNA片段不均一。,1988年: Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，扩增的DNA片段均一，特异性高。但不耐高温, 每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等: 从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶: 耐高温，93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在952h后残留活性: 40%. 1):不必在每次扩增反应后再加新酶; 2):大大提高了特异性, 扩增效率和灵敏性，增加了扩增长度(2.0Kb)。此酶命名为Taq DNA多

6、聚酶(Taq DNA Polymerase)。Taq DNA多聚酶的发现使PCR得以广泛应用。,1993年: Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖， 他所取得的成就是发明了PCR技术。,1998-1999年: Bill Clinton唯一一个在全美国人面前就自己的性丑闻事件道歉的美国总统, 因为 1): 有了 PCR技术, 2):不懂PCR技术。1998年，美国总统比尔克林顿曾当众宣称，他与白宫实习生莱温斯基“没有发生任何性关系”，但莱温斯基随后出示了一条沾有克林顿精液的蓝裙子。8个月后，克林顿不得不被迫承认错误,一样的PCR、一样的美国人,(二): PCR技术基本原理,PCR由变性-退火-

7、延伸三个基本反应步骤构成：1): 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右后，双链DNA变性为单链DNA ；2): 模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3): 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。,PCR的反应动力学 PCR的三个反应步

8、骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。最终的DNA 扩增量可用下列公式计算Y(1X)nY代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。,产物持续增加直到平台期,Theoretical increase,Log Target DNA,Cycle #,Y(1X)n,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期(Plateau).(引物、 dNTP反应原料消耗、 PCR 扩增效率及DNA聚合

9、酶种类和活性及非特异性产物的竟争等因素)。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR扩增产物 长片段产物 短片段产物长片段产物和短片段产物是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是向3端开始延伸， 其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限

10、定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。,“短产物片段”按指数倍数增加 “长产物片段”以算术倍数增加（原始模板拷贝X 循环次数， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。,Y(1X)n,PCR 原理 演示 :,(三): PCR反应体系,标准的PCR反应体系：Total volume 100ul(20-100ul)10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.

11、5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,PCR反应五要素： 引物、Taq酶、dNTP、模板、 Mg2+,1: 引物：引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.引物量： 每条引物的浓度10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配, 非特异性扩增和二聚体的机会。,设计引物应遵循以下原则：1): 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 2): PCR产物： 200-500bp，

12、可扩增长至30kb的片段。 3): 引物碱基：G+C含量以40-60%，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免4个单一碱基的连续出现。 4): 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体。,Stable Interaction,Amplification,Primer Dimers,5): 引物3端的碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6): 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性. 7): 引物5端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好处。

13、在算Tm值时不算, 但在检测互补和二级结构是要加上它们 8): 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) 9): 最好学会使用一种design software. PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.,设计引物应遵循以下原则续：,2: 酶及其浓度 两种Taq DNA聚合酶: 1):一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶2): 基因工程酶催化一典型的PCR反应约需酶量: 2.5U(总反应体积为100ul)浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物

14、量减少。,3: dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。用1M Tris.HCL的缓冲液7.07.5配成高浓度后，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,4: 模板核酸DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。一般临床检测标本，可采用快速简便

15、的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用Kit提取，要防止RNase降解RNA，。,5: Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,(四): PCR反应条件: 温度 (变性-退火-延伸)时间 (变性-退火-延伸)循环次数,1: 变性温度与时间： 94 30-60 sec变性温度低，解链不完全。一般情况下，93941min足以使模板DNA变性温度过高，高温环境对酶的活性有影响。不完全变性，就会导致PCR失败。,2: 退火温度与时间： 4060 3060sec退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,