《细胞生物学自主设计性实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物学自主设计性实验（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细胞生物学自主设计性实验,二班第二组 组员：,主题：观察衰老细胞中线粒体数变化,目的：1、掌握线粒体活体染色原理及方法2、了解动物细胞不通时期细胞内线粒体形态、数目、分部特征3、初步掌握哺乳动物细胞传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础,原理,1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生变化。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。 詹纳斯绿B（Janus green B）是活体染色中重要的染料，对线粒体有专一性。詹纳斯绿B解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的
2、作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基,2、活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。 但不是任何染料都可作为活体染色剂使用，一般应选择
3、那些无毒或毒性小的碱性染料（易溶于类脂质）并配成较稀的溶液来使用。,3、从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1
4、：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。,实验材料,一、器材：显微镜、温箱、刀片、镊子、剪刀、解剖盘、载玻片、盖玻片、吸水纸、倒置显微镜、培养箱、电动枪、培养板、吸液枪、5ml玻璃吸管、超净台,二、材料：小白鼠、1%Janus green B 染液、0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清）、 Hanks液、碘酒,实验方法,1、将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精
5、泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取肝组织带入超净台内，置平皿中。2、用手术剪将组织剪成小块（1mm3），再用Hanks液洗三次，视组织块量加入5-6倍体积的0.25%胰酶液，37中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。3、加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用。静置5-10分钟后1000rpm，离心10分钟，弃上清液。4、加入Hanks液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 加入培养液1-2ml（视细胞量），血球计数板计。将细胞调整到5105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37下培养。,5、取部分原代细胞染色
6、制片观察线粒体数，拍照。6、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。加入12ml 0.25胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。7、马上吸走胰酶液 ，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟。8、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，根据比例来取需要的量，加入4ml左右的培养液。9、前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱。10、查阅资料了解小鼠肝细胞体外培养分裂周期，在每次分裂后取部分细胞染色制片观察，拍照。11、直至细胞不在分裂，观察所有照片对比线粒体数目。12、分析讨论得出结论。,结论,随着细胞传代数目的增加，培养细胞内线粒体数量呈逐渐减少的趋势，体积也在逐渐变大。,
