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1、PCRSSCP技术检测胃癌p53基因异常,09生物科学 521宿舍 钟群 张媛燕 李思 吴福云 庄莉莉,何为PCRSSCP技术？,聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP） Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(
2、PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.,PCR扩增靶DNA,将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将特异的PCR扩增产物变性（94高温下热变性10 min）， 而后快速复性（迅速冰浴10 min），使之成为具有一定空间结构 的单链DNA分子,最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.（若发现单链DNA带迁移
3、率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变）,一般过程：,SSCP的应用：,自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.,胃癌高危,在日本，早期胃癌的检出率已达到60%70%；在韩国，早期胃癌的检出率在50%左右；而在中国早期胃癌的检出率平均只有10%。90%中晚期胃癌的五年生存期不足20%；全球每年94万的胃癌新发病例其中有40万中国人；每年近30万国人死于胃癌，平均23分钟就有一位国人因
4、胃癌死亡因此 ,胃癌的防治十分重要。,1、将细胞迅速移入已准备好的20 l消化液中，37过夜；PCR前煮沸510分钟，灭活蛋白酶K，冷却后6 00010 000 r/min离心，取5 l上清液DNA进行PCR扩增。,利用PCR-SSCP技术检测胃癌：,2、聚合酶链反应（PCR）：引物序列如下： 第5外显子(E5):5-TACTCCCCTGCCCTCAACAA-3,5-CATCGCTATCTGAGCA GCGC-3。 第6外显子(E6): 5-GTCTGGCCCCTCCTCAGCAT-3，5-CTCAGGCGGCTCATAGGGCA-3。 第7外显子（E7）: 5-TCTGACTGTACCACC
5、ATCCA-3，5-C TGGAGTCTTCCAGTGTGAT-3。 第8外显子(E8): 5-TGGTAATCTACTGGGACGGA-3， 5-CGGAGATTCTCTTCCTCTGT-3。 第49外显子(E49): 5-GGAGGTGCTTACACAT-3， 5-GTTAGCTACAACCAGG-3。E4-9序列与4和9外显子两侧的序列互补，其扩增片段为49外显子，长约1 790 bp。,第一轮PCR循环：总体积50 l ， E49引物20 pmol；DNA提取液5 l；10PCR缓冲液5 l；MgCl2 2 mmol/L；dNTPs 200 mol/L；TaqDNA多聚酶1U（均为Pr
6、omega产品）。反应条件为95变性5分钟，60退火40秒，72延伸1.2分钟，共30个循环。,第二轮PCR循环：总体积50 l ，一对外显子引物，各20 pmol；第一轮PCR扩增产物5 l ；10PCR缓冲液5 l；MgCl2 2 mmol/L；dNTPs 75 mol/L；TaqDNA多聚酶1 U（均为Promega产品）。反应条件为93变性3分钟，64退火 40秒（E5、E6），或60退火 40秒（E7、E8），72延伸 70秒，共35个循环。,3、单链构象多态性（SSCP）分析：取第二轮PCR扩增产物5 l与等量变性上样液混匀，沸水中变性后上样，12%非变性聚丙烯酰胺电泳，硝酸银染色
7、观察结果,PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（下图）。同一病例的胃粘膜和胃癌细胞来自同一张切片，这样在C泳道上出现的条带，如果与对应的N泳道上不同，即被认为是产生了突变。,结果分析：,N:正常粘膜细胞DNA扩增条带； C:癌细胞DNA扩增条带；相邻的N、C皆取自同一张组织切片； 图中2号病例示p53突变阳性,细胞DNA PCR-SSCP结果,SSCP的结果断定：,单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链带.PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链.如变性不彻底,残留双链亦可形成一条带因此,PCRSSCP分析结果至少显示三条带.但是,由于一种DNA单链有时可形成两种或多种
8、构象,检出三条或四条单链带就不足为奇. 由于在SSCP分析中非变性PAGE电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小。,一般认为,如没有污染,PCRSSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时.如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带.由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果.应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在
9、很大程度上是可以避免的.但对未知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除.,SSCP技术要求,1、核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高. 对于200bp的片段,SSCP可发现其中70的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片段,则仅能检出103O的变异, 对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400bP的DNA片段,再进行SSCP分析.,2、游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响.因此,应尽可能除去游离引物.可以采用不对称
10、引物扩增方法,尽可能消耗多余的引物.也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物.或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰.,3、低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂,如5-10甘油、5尿素或甲酸胺、10二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因为轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率.但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出.因此,对同一序列使用23种条件做SSCP,可能提高敏感性.,4、电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出.室温下电泳
11、适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应采取以下措施：减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷却或循环水冷却等.,5、凝胶浓度、厚度与长度 凝胶浓度很重要,一般使用58的凝胶,凝胶浓度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率.凝胶的厚度对SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝胶越薄越好。凝胶板长度在40cm以上。,PCR-SSCP检测基因突变优点：,灵敏度高，0.1ug以下的微量模版DNA即可进行检测，并且与DNA长度、纯度无关。在癌组织中混有正常组织情况下，亦可根据异常区带的出现得以检出，不受正常组织干扰。微小的变异即使1个bp的变化或等位基因中的一个基因的变异也可检出。,快速、简捷，不使用限制性内切酶消化及DNA探针杂交等。检测大量标本室可用SSCP筛选异常基因，异常区带自凝胶中溶出后，经不对称PCR扩增产生单链直接测序，避免无选择的大量测序。PCR-SSCP是目前检测点突变最简捷的方法。 特异性高，选择不同的引物可对基因的不同片段进行检测，具有高度特异性和针对性。,谢谢！,
