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1、PCR仪和凝胶成像系统,仪器分析实验分子生物学实验技术,药学院：刘明华,内 容,PCR的反应原理及反应体系PCR示例凝胶成像系统,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B. Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（I II III）,拓扑异构酶 解旋酶类 SSB,引物 dNTP Mg2+,模板,Mullis的PCR构思,引物,引物,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,模板,Mg2+,dNTP,th
2、ermus aquaticus,Taq DNA多聚酶的发现,1988年Saiki 等从温泉（ Hot spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。,Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process,PCR反应条件,温度三点法,温度、时间和循环次数。,PCR反应条件 变性 使双链DNA解链为单链94， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。一般为4565, 30秒,PCR仪,（3
3、）延伸70-75,一般为72延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp （4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,PCR的基本原理,PCR的基本原理小结,变性、复性、半保留复制,一生二，二生四，四生万物,PCR三步曲,变性 9097,退火 4565,延伸 7075 ,PCR过程,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,用途广泛,生命学科 肿瘤 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学,PCR示例,一、实验目的,学习PCR分析的原理与技术。,二、实验材料、仪器和试剂,1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T质粒DNA 2、仪
4、器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂： 10XPCR 反应缓冲液25mmol/L MgCl210mmol/L dNTP10mol/L 引物1和引物2,1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L25mmol/L MgCl2 2.0L10mmol/L dNTP 1.0 L10mol/L 引物1 1.0 L10mol/L引物2 1.0L质粒DNA 1.0 LTaq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L,三、操作步骤,9496 30-3 预变性（使模板充分变性）94 30 变性 45-65 30-1 复性（使引物与模板
5、充分退火） 72 n 延伸 (按1扩增1kb计算） 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整） 4-10 保存,25-35 个循环,2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为,英国Techne多功能型PCR仪TC-412,3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。,PCR?,PCR只是一个简单的不起眼玩艺凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnolog
6、y by Paul Rabinow,以PCR为基础的相关技术,逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 实时荧光定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位PCR (in situ PCR),逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),荧光定量PCR(FQ-PCR),融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团),多重
7、PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性,多重PCR (multiplex PCR),原位PCR(In situ PCR) 原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定蛋白酶消化原位PCR扩增冲洗产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位,锚定PCR(anchored PCR)： 引进锚定引物，可以克服序列未知或序列未全知的障碍。 在DNA3-末端加上poly(dG)尾，与此相对应的锚定引
8、物poly(dC)一般应在十二聚以上。,不对称PCR(asymmetric PCR) 不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。,差别PCR (differential PCR) 差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。,ChampChem
9、i Basic系列全自动化学发光/荧光/可见光成像分析系统,可对各种化学发光、荧光、可见光图像进行拍摄和分析: 核酸检测 各种荧光染料，如EB, SYBR Green 蛋白检测 考马斯亮蓝胶，银染胶以及荧光染料如Sypro Red, Sypro Orange, Pro-Q Diamond, Deep Purple标记胶/膜/芯片等；化学发光检测 Western Lightning, ECL, ECL plus, SuperSignal等发光底物； 其他应用 各种杂交膜，蛋白转印膜，培养皿菌落计数，酶标板，点杂交，蛋白芯片，TLC板,应用范围,EB染色应用于双Marker DNA琼脂糖凝胶电泳成
10、像,SYBR Green荧光染料应用于DNA琼脂糖凝胶电泳的成像,考马斯亮蓝染色玉米种子蛋白质SDS-PAGE电泳的凝胶成像,微孔板荧光成像,ECL发光底物检测小鼠BSA蛋白的蛋白免疫印迹（Western Blot）的成像,SuperSignal发光底物检测West Pico底物,克隆计数,抑菌圈成像和分析,昆虫的成像和测量,分析功能,可自动识别各种电泳图像条带，自动生成峰值曲线图，自动计算分子量、条带含量、百分比、IOD值、等电点等数据，并可进行PCR密度分析；分子量标准数据库可进行各种标准Marker的保存和调用，更可对双Marker电泳进行校正。软件可对各种克隆计数、微孔板、抑菌圈、物体切片图像进行计算和分析。所有数据、图像、图形均可导出至Excel 、Word 粘贴板、画图等软件或其它文件中。,The End！,
