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1、基因扩增检验专业现场评审方法和技巧,医学实验室评审员持续培训/ 评审组长同级转换培训班 上海,现场评审的基本思路,基因扩增检验实验室均经过卫生部临床检验中心的技术验收，验收标准又基本参照了ISO15189认可准则的要求，所以，在评审准备要实验室提供验收合格证书 日程安排上不能因通过了技术验收而忽视了PCR实验室的认可 重点关注申请的项目是否都有批文、各项记录是否完善等内容,常见不符合项举例及分析,HBV-DNA可报告范围为103108，HCV-RNA可报告范围为103107，标准曲线和室内质控的浓度设定都在104以上，建议观察103低浓度值。 有一位从事临床基因扩增检验工作人员未获得培训合格证
2、书,分区,现场评审的重要环节,检验前程序（PCR技术验收表6标本管理）验收表比较简单，应注意RNA、分泌物等标本的采集、运输和保存 检验程序（见后） 检验后程序（注意TAT是否满足质量目标的要求；报告单所必须包含的内容） 座谈会（要了解临床对定量HBV-DNA；性病检测）,DNA、RNA的保存,DNA标本无菌条件2-8保存不超过3天，超过3天- 20 。标本长期保存应在-70。避免多次反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。 RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。
3、所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin）， 终浓度为2U/10l，置-20保存备用。冰块上操作为宜。,其他标本,棉拭子生理盐水充分振荡洗涤、静置510min、取上清、离心、沉淀物提DNA。如不立即提取，存70 脓液沉淀标本的保存同样为70 体液沉淀标本的保存同上,检测系统,校准（加样器、温湿度计、扩增仪）查看文件与实际校准的情况频度：首次（新安装）；后续（主要部件维修，强制周期如 每年，不定期）PCR仪：温度准确度及升降速率；荧光本底；激发及吸收波长的准确度、杂闪光、重复性、线性,检测系统,比对没有开展
4、室间质评的项目；比对的结果 性能验证新启用的设备 维护保养 保养程序、操作手册严格按照仪器使用手册编写，包括日、周、月、季、半年、年 标识（时间、名称） 记录,现场评审的关注点,检测系统 室内质控 室间质评 溯源及测量不确定度 现场试验,人员能力 检验前程序观察 检验报告 生物安全 座谈会,室内质控,采用一系列统计学的方法连续地评价检测工作的可靠程度，判断检验报告是否可以发出的过程 目的是控制本实验室测定工作的精密度，监测其准确度的改变，提高常规检验工作的批间、批内标本检测结果的一致性 室内质控规则的制定是否合理（质控图、质控水平、质控频率）每次现场验收问题最多的地方,室内质控,质控目的：假阴
5、性、假阳性，准确性、精密度 质控点：样本质量、模板提取、扩增效率 质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品 控制范围：空白、阴对-阴性弱阳对-阳性（上下一次方）标准品-r值（ - 0.998）斜率（-3.1- -3.5）截距（40左右；达安 30）点间CT值 （3.3左右）,如何确定阈值,基线的作用（Baseline cycles ）消除检测中背景荧光信号的影响，确定阈值基线的范围：仪器一般默认的范围（应根据试剂合要求）PE-5700 、PE-7000 3-15iCycle 2-10 LightCycle 3-12 基线需根据实验结果进行适当调整：延长基线以包括最高浓度样本扩增曲线起跳前尽可能多
6、的循环，可以使扩增曲线更平滑、数据也得到一定改善。,阈值线,荧光阈值线的调整需根据实验结果进行适当调整1、落在阴性对照线最高点上方2、外标准扩增曲线的均一位置（点间CT3.3左右）3、尽量接近扩增曲线刚真正进入指数扩增期的位置（避免弱阳性漏检以及一些扩增反应影响因素在指数期的放大）,Threshold Cycle Calculation: Baseline cycles Through Threshold Position,2,14,20.8,标准曲线,通过基线和荧光域值线的调整应达到：相关系数（ r值） 0.998斜率 -3.0 -3.5截距 -404 （这些参数根据仪器和试剂有所不同）,室
7、间质评,参加卫生部及省内质评计划 原始记录及结果报告 室间质评结果分析报告（如果没有分析报告，应该开观察项还是不符合项？开在哪一条？） 不符合项（原因分析及整改措施有效性）,溯源及测量不确定度,检测系统配置的基本情况 溯源性确认的基本原则 不能溯源时，结果可靠性的确认原则 测量不确定度（评审把握的尺度、具体举例）,现场试验,现场试验选择的原则 现场试验的方式（人员比对） 现场试验结果分析和判定 盲样试验的基本要求,人员能力,评审方式（查看技术人员档案、提问、现场试验、现场操作） 理论知识（防污染知识、生物安全知识） 技术能力 问题处理（发现问题、分析问题和解决问题的能力）,座谈会,座谈的原则与
8、技巧（了解、关注临床新技术新进展） 关注的关键问题（明确几个必问的与专业相关的问题）, 100,000,10,000- 99,999,HBV DNA 与肝细胞癌和肝硬化发生危险升高相关,REVEAL: 长期随访台湾未治疗的HBsAg阳性个体,基线HBV DNA (拷贝/mL),患者(%),随访13年 累积肝细胞癌的发生率1 (N = 3653),50,40,30,20,10,0,1.3,1.4,3.6,12.2,14.9,随访13年 累积肝硬化发生率2 (N = 3582),4.5,5.9,9.8,23.5,36.2, 300,300- 999,1000- 9999, 300,300- 999
9、9,10,000- 99,999,100,000- 999,999, 1 million,1. Chen CJ, et al. JAMA. 2006;295:65-73. 2. Iloeje UH, et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.,1.00,0.96,0.92,0.88,0.84,0.80,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,Survival distribution function,Survival time (years),HBV DNA High (+) RR=9.9 (3.231.0),HBV DNA Low
10、 (+) RR=1.8 (0.55.8),HBV DNA (-),Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster 1362,HCC 病死率与基线HBV病毒载量的关系,HBV DNA Low (+) RR=1.5 (0.211.8),HBV DNA (-),HBV DNA High (+) RR=13.4 (1.997.1),Chen G et al. 55th AASLD Boston, Nov 2004; Poster 1362,1.00,0.96,0.92,0.88,0.84,0.80,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,Survival time (years),Survival distribution function,慢性乙肝病死率（除外HCC）与基线 HBV病毒载量的关系,小结,技术验收不能替代现场评审 PCR检测手工操作多、过程复杂、技术要求高、人员素质也应该高 对评审员的要求也高,谢谢！,
