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1、第四章 体外放射分析,核医学教研室,教学目的,掌握体外放射分析的原理（RIA、IRMA） 掌握RIA与IRMA的异同 掌握RIA、IRMA的基本操作程序 掌握RIA、IRMA的基本试剂 了解体外放射分析试剂的要求 体外放射分析B与F的常见分离方法,重难点,重点：1、RIA、IRMA的原理2、RIA、IRMA的异同点 难点：1、RIA的原理,体外放射分析指在体外实验条件下，以特异结合反应为基础，以放射性测量为手段，对生物活性物质进行超微量分析的总称。 特点：灵敏度高、特异性强、精密度好、应用范围广、方法简便。,一 体外放射分析的概述,（一）特异性结合1、抗原与抗体2、配体与受体3、底物与酶4、激
2、素与血浆结合球蛋白,（二）结合反应动力学规律L+B=LB1、竞争性结合分析L+*L+B=LB+*LB 2、非竞争性结合分析Sp.Ab1+Ag=SpAb1.Ag+*Ab2=Sp.Ab1. Ag.*Ab2+*Ab2,（三）放射性测量放射性测量是定量的基础,第一节 放射免疫分析 radio innumo assay,RIA,竞争放射分析,放射免疫分析（Radio Immuno Assay, RIA） 竞争性蛋白结合分析（Competitive Protein Binding Assay, CPBA） 放射受体分析（Radio Receptor Assay, RRA）,L+*L+B=LB+*LB,（一
3、）放射免疫分析原理,*Ag+Ag+Ab =(*AgAb)+(AgAb)+*Ag + Ag0 Max Min 条件： 1、 *Ag定量、足量 2、 Ab限量 *AgAb,放射性计数,Ag,Ag与*Ag-Ab成反比！,专用符号：1、T (Total): 加入的*Ag的放射性计数2、B (Bound): *AgAb免疫复合物的放射性计数3、B0 Ag=0时*AgAb放射性计数4、F (Free): 游离的*Ag的放射性计数 T=B+F5、NSB(Non-specific binding): 非特异性结合产生的放射性计数6、结合率：B/T、B/B0、B/F,*Ag+Ag+Ab =(*AgAb)+(Ag
4、Ab)+*Ag + Ag,不同坐标体系对应RIA剂量反应曲线,（二）RIA的三种基本试剂,标准品（Ag） 标记物（ *Ag） 抗体（Ab）,放 射 性 免 疫 及 免 疫 放 射 分 析 试 剂 盒,1、标准品,化学结构：应与被测物具有相同的化学结构 化学纯度：纯品 化学度量：准确 稳定性：保持生物活性不变,2、标 记 物,要求：1、较高的比活度2、生物活性与免疫活性：与标记前一致3、放射化学纯度：95%4、稳定性 鉴定：1、最大结合率2、标准曲线比较法3、稀释曲线比较法,3、抗体,要求：1、亲和力 2、高滴度3、特异性 4、可长期保存,抗 体,抗原 动物选择 佐剂 免疫动物、收获鉴定抗体,一
5、、多克隆抗血清,抗血清的鉴定,亲和力：指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。 特异性：抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用交叉反应率（Cross Reaction）表示交叉反应率=Y/Z100%Y：标准抗原取代50%结合率所对应的浓度Z：类似物取代50%结合率所对应的浓度 滴度：结合50%标记抗原时血清的稀释度,单 克 隆 抗 体,特点：特异性高抗体成分专一可反复制备,制备：1、免疫小鼠，制备脾细胞悬液 2、选择培养，用HAT培养基筛选杂交瘤细胞3、检测抗体4、克隆化,（三）分离方法,1、分离方法的要求1、使结合部分与游离部分尽可能完全分开2、分得的成分便于作放
6、射性操作3、分离效果不受外界干扰因素影响4、操作简便、分离迅速、重复性好5、试剂来源广泛、价廉易得,2、常用的分离方法,聚乙二醇法（PEG） 活性炭吸附法 盐析法 微孔滤膜法双抗体法 SPA法 固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球 磁化颗粒法,非特异性分离方法,特异性分离方法,（四）放射免疫分析方法的建立,1、反 应 方 式,平衡法 顺序加样法 STAT法,2、加样程序,实验设计 配制试剂 加未标记物（标准品或待测样品） 加标记物（*Ag） 加抗体（Ab） 混匀、温育 加分离剂、分离B与F 测量各管放射性计数，绘制标准曲线 由标准曲线反求出样品浓度,第二节、免 疫 放 射 分 析
7、（Immuno radio metric Assay,IRMA）,一、IRMA的原理及方法学,单位点系统 双位点系统 标记第三抗体法 双标记抗体法,1、单位点系统：,Ag,放射性计数,Ag与Ag-*Ab成正比！,2、双位点系统,用抗原的二株单克隆抗体，一株制备固相抗体（ Ab1 ）与标准品或待测样品中的抗原（Ag）结合反应，加入另一株制备标记的抗体（*Ab2），最终结合形成固相抗体抗原标记抗体（Im-AbAg*Ab）复合物，剩余的标记抗体（*Ab）呈游离液态被分离。Ab1+Ag Ab1.Ag+*Ab2 Ab1Ag*Ab2+ *Ab2,Ag与Ag-*Ab成正比！,Ag,放射性计数,3、标记第三抗
8、体及生物素-亲和素系统,二、IRMA的特点,1、示踪剂：标记抗体 2、反应动力学：无竞争，反应速度更快 3、灵敏度：更高 4、特异性：二株单抗，交叉反应率更小 5、标准曲线工作范围：更大，但应注意“倒钩效应” 6、方法稳定性好：加样误差仅来自抗原 7、不足：目前仅能检测大抗原,三、RIA与IRMA的异同,1、二者相同点：1、均为免疫结合反应；2、均检测抗原；3、反映的是抗原的免疫活性；4、以放射性测量为手段。,2、二者主要区别,非放射性标记免疫分析技术,酶标记免疫分析法 化学发光法 时间分辨免疫荧光分析法 基因芯片技术,思考题,1、名词解释：体外放射分析、RIA、IRMA、T、F、B、B0、NSB、 2、简述RIA、IRMA的原理。 3、简述RIA、IRMA的异同点。 4、简述常用的体外放射分析B与F的分离方法,
