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1、第十三章,生化药物和基因工程药物 分析概论,化学药物 生物药物 中药,药品,第一节 概述,一、生物药物,利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理和方法制备的一大类药物。,包括：生化药物、生物技术药物、生物制品。,（一）生化药物（biochemical drugs）从动物、植物及微生物中提取的，用生物化学半合成制备的或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等。,二、生物药物的分类,分为：1. 氨基酸、多肽与蛋白质类2. 酶类与辅酶类3. 多糖类4. 脂质类5. 核酸及其降解物和衍生物类药物,常见生化药物：
2、复合氨基酸、脑多肽、牛纤维蛋白原、水蛭素、生长素、催乳素、天花粉蛋白、辅酶Q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸软骨素A、灵芝多糖、透明质酸、黄芪多糖、人参多糖、胆酸类、RNA、DNA、ATP、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖腺苷、环胞苷等。,门冬酰胺酶（抗肿瘤药） Ch.P（2005）二部 本品系自埃希大肠杆菌（E.coli ASI.357） 或欧文菌（Er-winia casotovora）中提取制备的 具有酰氨基水解作用的酶。,肝素钠（抗凝血药） Ch.P（2005）二部本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨 基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。,门冬酰胺（氨基酸类药） Ch.P（2005）本
3、品为门冬酰胺一水合物。按干燥 品计算，含C4H7NO4不得少于98.5%。,（二）基因工程药物（genetic engineering drugs）,生产,重组DNA技术改造,确定对特定疾病有预防和治疗作用的蛋白质,导入受体细胞繁殖,分离、纯化或人工合成控制该蛋白质合成的基因,包括：,1. 激素类及神经递质类 2. 细胞因子类 3. 酶类及凝血因子类,收载在中国药典（2005年版）第三部,常见基因工程药物：人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素、促红细胞生成素、集落刺激因子，疫苗 、白介素、单克隆抗体、生长因子、内啡呔、肿瘤坏死因子等。,（三）生物制品是以微生物、
4、细胞、动物或人源组织 和体液等为原料，运用传统技术或现代生 物技术制成，用于人类疾病预防、治 疗和诊断的药品。,收载在中国药典（2005年版）第三部,生物制品主要有疫苗、免疫血清、血液制剂、免疫调节剂（胸腺肽、免疫核糖核酸）和诊断试剂。,中国药典中的生物制品包括以下六个方面：疫苗（含细菌类疫苗、病毒类疫苗及联合疫苗；抗毒素及抗血清；血液制品；重组DNA制品；体内诊断制品；其他生物活性制剂。,三、生物药物的特点,1. 共同特点：来源于生物体，是生物体的基本生化成分，对疾病的治疗针对性强、毒副作用小、易为人体吸收。,2. 相对分子质量的确定,3. 结构确认难 生化法确证结构,4. 全过程的质量控制
5、质量不稳定，要更严密的进行控制，比传统工艺生产的药物有更高的要 求，要进行生物活性和安全性的检查。,5. 生物活性检查,细胞色素C溶液 Ch.P（2005） 【检查】 活力 照细胞色素C活力测定法 （附录 B）测定，不得低于95.0%。,尿激酶 Ch.P（2005） 【检查】 凝血质样活性物质 凝血质样活性为零值时的供试品酶活力，按每1ml中供试品的单位表示，每1ml应大于150单位。,6. 安全性检查,热原检查、细菌内毒素检查 过敏试验、降、升压物质检查 异常毒性检查、无菌检查 致突变试验、生殖毒性试验,7. 效价（含量）测定,第二节 质量检验的基本程序与方法,一、鉴别试验,（一）理化鉴别法
6、1. 化学鉴别法,胃蛋白酶 Ch.P（2005） 【鉴别】取本品的水溶液，加鞣酸、没食 子酸或多数重金属盐的溶液，即生成沉淀,谷氨酸钠 Ch.P（2005） 【鉴别】（1）取本品约5mg，加水1ml使 溶解，加茚三酮试液数滴，加热，溶液显 蓝色至紫蓝色。,2. 紫外分光光度法,腺苷钴胺 Ch.P（2005） （1）氯化钾溶液中：max在264nm、285nm、305nm及460nm （2）磷酸盐缓冲液（pH7.0）中， max在261nm、525nm,3. 高效液相色谱法,重组人胰岛素 Ch.P（2005） 【鉴别】 在效价测定项下记录的色谱 图中，供试品溶液主峰的保留时间应与 对照品溶液主峰
7、的保留时间一致。,1. 酶法高效、专一的催化某些生化反应。 如尿激酶的鉴别。,（二）生化鉴别法,牛纤维蛋白酶,+,溶解,2. 电泳法,肝素钠 Ch.P（2005） 【鉴别】（1）取本品与肝素标准品，分别加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，照电泳法（附录F第三法）试验，供试品和标准品所显斑点的迁移距离之比应为0.91.1。,加电压在两个电极槽中，电解质迁移造成pH梯度。,3. 等电聚焦电泳法,蛋白质为两性化合物，其所带电荷与pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当其达到等电点（此处的pH值使蛋白质不再带电），不再移动产生聚焦带。不同等电点的蛋白质聚焦在不同位置而得到分离。,（三
8、）生物鉴别法,利用生物体对药物的反应来鉴别 药物。 如利用家兔的惊厥反应来鉴别胰 岛素。,二、检查,（一）杂质检查,1. 一般杂质检查,2. 特殊杂质检查,如胰蛋白酶中靡蛋白酶的检查， 肌苷中次黄嘌呤的检查。,（二）安全性检查,1. 热原检查和细菌内毒素检查,细菌内毒素：鲎试剂法,热原：家兔法,2. 异常毒性试验,使动物急性中毒死亡的物质的限 量检查。以动物死亡与否为终点。试验动物：小鼠,3. 过敏试验,检查药物中的异性蛋白。,实验动物：豚鼠,4. 降压物质试验,降压物质：药物中是否存在能使血压降低的物质，包括组胺、类组胺或其他物质,5. 无菌检查法,检查药物中是否染有活菌。许多 生化药物不能
9、高温灭菌，需在无菌条 件下制备。,6. 基因工程药物中可能杂质与污染物检查,（1）外源性DNA测定 （2）其他外源性杂质（与制造工艺相关）,7. 致突变试验,8. 生殖毒性试验,三、效价（含量）测定,1. 结构明确的小分子药物,结果表示方法：百分含量,测定方法：理化法,2. 蛋白质、酶类,测定方法：生化法、生物检定法,结果表示方法：生物效价或酶活力单位,第三节 常用定量分析方法与应用,一、理化分析法 （一）化学分析法,甘氨酸 Ch.P（2005）【含量测定】 取本品约70mg，精密称定，加无水甲酸1.5ml使溶解，加冰醋酸25ml，照电位滴定法（附录 A），用高氯酸滴定液（0.1mol /L）
10、滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于7.507mg的C2H5NO2。,（二）电化学分析法,电位法、伏安法、极谱法、 永停滴定法、示波滴定法、 极谱氧电极法、微电流电位法、 生物传感器技术、 离子选择性电极分析法,（三）光谱分析法1. 紫外可见分光光度法（1）比色法（2）紫外分光光度法2. 荧光分光光度法,细胞色素C溶液 Ch.P（2005）【含量测定】 精密量取含铁量项下的供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用鉴别（2）项下的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，加连二亚硫酸钠约15mg，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在约550nm的波长处，以间隔0
11、.5nm找出最大吸收波长，测定吸光度，按细胞色素C吸收系数（ ）为23.0计算，即得。,五肽胃泌素 Ch.P（2005）【含量测定】取本品适量，精密称定，加0.01mol/L氨溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含50g的溶液，照分光光度法（附录 A），在280nm的波长处测定吸收度，按C37H49N7O9S的吸收系数（ ）为70计算，即得。,（四） 色谱法,1. 高效液相色谱法,2. 灌注色谱法,辅酶Q10 Ch.P（2005）固定相 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 甲醇-无水乙醇（1：1）检测波长 275nm,环孢素 Ch.P（2005）固定相 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 乙腈-水-四丁基甲醚-
12、磷酸（430：520：50：1）检测波长 210nm,二、酶法,原理：利用酶能专一而高效地催化某些化学反应，通过对酶反应速度的测定、反应物或生成物浓度的测定来检测相应物质的含量。,生化药物定量的主要方法,（一）酶活力测定法,是以酶为分析对象的分析，目的在于测定某种酶的活力或活性，用酶活力单位和比活性表示。,酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。,酶活力测定是测定一个被酶催化的化学反应的速度，可以用单位时间内底物的减少或产物的增加表示，酶反应速度越快表示酶活力越高,2. 酶分析法,以酶为分析工具或分析试剂的分析方法，用酶作试剂测定样品中酶以外的其它物质的含量。分析对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至
13、酶抑制剂。,胃蛋白酶的活力测定 Ch.P（2005）,规定每1g中含蛋白酶活力不得少于3800单位。一蛋白酶活力单位：每分钟能催化 水解血红蛋白生成1mol酪氨酸的酶量。,（水解）,三、电泳法,在电解质溶液中，带电粒子或离子 在电场作用下，以不同的速度向其所带 电荷相反方向迁移的现象叫电泳。它主要是利用物质在电场中迁移速 度的不同进行分离。,常见电泳的分类：,1. 自由界面电泳（U型管）溶液中不同分子在电场作用下各 自聚集而形成明显的界面。,2. 区带电泳（惰性支持介质）在电场作用下，使具有不同泳动 速度的组分形成各自的区带。,3. 高效毛细管电泳,是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配系数的不同而进行分离的一类新型液相分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。,四、生物检定法,利用药物对生物体（整体、离体或微生物）的作用以测定其效价或生物活性，一般采用标准品或对照品对照法。,应用范围：,1. 药物的效价测定无适当理化方法或理化测定结果不 能反映临床效果，如肝素。,肝素生物测定法：,血浆,延长凝结的时间,2. 大分子结构的测定,3. 微量生理活性物质的测定,4. 药物的毒性成分及杂质的限度检查,5. 新药研究,
