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1、常用实验技术简介,黄雪娜 2011-8-4,目 录,全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术,全长cDNA克隆,是许多后续更深入实验的基础；真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；全长cDNA克隆方法：灵活掌握； 同源克隆技术 RACE-PCR技术,基因克隆前的准备工作,看有没有被别人克隆出来； 查看文献了解基因的功能及表达特征； 了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计划； 了解相近物种该基因的信息，以利于扩增过程中预测PCR的延伸时间；,同源片段的克隆,本实验室的EST数据库； NCBI数据库； RT-PCR用兼并引物扩增同源片段； 设计兼并引物是重点
2、！,注意事项：,高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析；,3RACE:,原理：,5RACE,原理：,注意事项：,RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录；,序列分析,引物设计：Primer 5.0； 一般的序列处理：DNAStar中的Editseq； 序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2； 序列在线比对：NCBI-BLAST ( http:/blast.
3、ncbi.nlm.nih.gov/ )； 序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)； 寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html )； 序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http:/emboss.bioinformatics.nl/ )； 构建进化树:MEGA 4.1；,蛋白结构域分析：SMART( http:/smart.embl-heidelberg.de/ )； 蛋白理化性质分析及二、三级结
4、构分析：EXPASY( http:/www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )； 信号肽分析：SignalP( http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )； 磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )； 糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；,引物设计,兼并引物 RA
5、CE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物,总原则, 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。,兼并引物,兼并碱基：M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T 简并度：,兼并引物设计步骤,利用ncbi
6、搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 对所找到的序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计兼并引物（软件或者人工）,选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR;,RACE引物,各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3RACE，再做5RACE； 尽量靠近cDNA末端（3RACE-3末端； 5RACE-5末端）；,荧光定量引物,纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析；,染色体步移引物,以DNA为模板设计引物； 3条重叠引物； 高的退火温度：高于60度；,原核表达用引物,会读表达载体图谱； 去除信号肽序列； 根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注意要不要加终止密码子； 在引物的5末端加酶切位点和相应的保护碱基，注意方向； 选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶是否可以在统一体系中进行双酶切；,PCR-SSCP引物,PCR产物长度：150-400bp； 高的特异性；,染色体步移克隆启动子,Tail-PCR,荧光素酶活性检测试剂盒,谢 谢！,
