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1、1第第 2929 讲讲 微生物的利用、浅尝现代生物技术微生物的利用、浅尝现代生物技术考试属性及要求 章知识内容 加试考查频率微生物的利用1.大肠杆菌的培养和分离2.分离以尿素为氮源的微生物2015 年 10 月第 32 题(1)(3 分) 2016 年 10 月第 32 题(一)(7 分)2017 年 4 月第 32 题(一)(1)(2 分) 酶的应用3.果汁中的果胶和果胶酶4.淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测2016 年 4 月第 32 题(一)(7 分)2016 年 10 月第 32 题(一)(4)(1 分)生物技术在食品加工中的应用5.果酒及果醋的制作6.泡菜的腌制和亚硝酸的测定201
2、7 年 4 月第 32 题(一)(2)(3)(5 分)浅尝现代生物技术7.植物的组织培养实验与探究能力(1)能独立完成“生物知识内容表”所列的生物实验(活动)，包括理解实验目的、原理、方法和操作步骤，掌握相关的操作技能，并能将这些实验涉及的方法和技能进行综合运用。(2)具备验证简单生物学事实的能力，能设计实验，提出或完善实验思路，能对实验现象和结果进行处理、分析和解释。(3)具有对一些生物学问题进行初步探究的能力，能提出问题、做出假设和预期、确认变量、设计实验方案、处理和解释数据、做出合理的判断，能对一些简单的实验方案做出恰当的评价和修订。2015 年 10 月第 32 题(3)(5)(3 分
3、)考点一 微生物的利用一、大肠杆菌的培养和分离1.大肠杆菌(1)特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。(2)细菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快。22.细菌的扩大培养扩大培养用 LB 液体培养基。3.分离划线分离用 LB 固体平面培养基。50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将培养基分别倒入 4 个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养 12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿培养皿倒置(盖在下面)，放在 37 恒温培养箱中培养 1224 h，可看
4、到划线的末端出现不连续的单个菌落培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察菌种保存在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养 24 h 后，置于 4_冰箱中保存4.消毒和灭菌比较条件结果常用方法应用范围紫外线消毒法接种室、超净台消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灼烧灭菌法接种工具灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子干热灭菌法玻璃器皿、金属工具3高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌过滤除菌不能加热灭菌的化合物，要用 G6 玻璃砂漏斗过滤二、分离以尿素为氮源的微生物1.菌种特点含
5、有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。2.培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以 LB 全营养培养基为对照。3.实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成 NH3，致使 pH 升高，使酚红指示剂变红。4.实验步骤制备培养基：将已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，平放至凝固制备细菌悬液：用 1 g 土样和无菌水配制不同浓度的细菌悬液用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有 LB 培养基和尿素培养基的培养皿中，每个浓度分别各接种到三个培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整
6、个平面上培养：将培养皿倒置，在 37 恒温箱中培养 2448 h观察：培养基中菌落数量5.反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色的环带。6.微生物接种的两种常用方法比较4比较划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液用无菌水进行梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别用涂布器涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，
7、从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，但操作复杂些目的使培养基上形成单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落1.(201510 月浙江选考 节选)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答：用_的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液_接种到含有抗生素的固体培养基上，经培养形成_，再进行鉴定和扩大培养。解析 在细菌涂布分离时，采用灭菌的玻璃刮刀将稀释后的菌液均匀涂布在固体培养基上，经培养形成单菌落，再进行鉴定和扩大培养。答案 灭菌 涂布 菌落2.(201610 月浙江选考 节选)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有
8、关问题：(1)LB 固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加_，灭菌备用。(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用_灭菌过的 G6 玻璃砂漏斗过滤，因为 G6 玻璃砂漏斗_，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。(3)取适量含产脲酶细菌的 104、105两种土壤稀释液，分别涂布接种到 LB 固体培养基和尿素固体培养基上，培养 48 h，推测固体培养基上生长的菌落数量最少的是_。5A.105稀释液尿素固体培养基B.105稀释液LB 固体培养基C.104稀释液尿素固体培养基D.104稀释液LB 固体培养基在尿素固体培养基上
9、产脲酶细菌菌落周围出现_，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生_所致。解析 (1)本实验中的 LB 培养基是要与尿素培养基作对比的，所以要用琼脂糖替换琼脂。(2)尿素培养基的灭菌要分开进行，除尿素外的其他成分仍用高压蒸汽灭菌，尿素溶液用G6 玻璃砂漏斗过滤除菌，再将除菌的尿素加到已灭菌的其他成分中。G6 玻璃砂漏斗由于孔径小，细菌不能滤过，可用于过滤除菌，但需要在使用前进行高压蒸汽灭菌。(3)由于在土壤中产脲酶的细菌远小于普通细菌，所以在尿素培养基上的菌落数相对少得多，另外稀释倍数高的土壤稀释液中细菌数量少，在培养基上菌落数也相对少。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现红色环带，这是因为
10、脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂在碱性下呈红色。答案 (1)琼脂糖 (2)高压蒸汽 孔径小，细菌不能滤过 (3)A 红色环带 氨(或 NH3)3.(20174 月浙江选考 节选)回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定有关的问题：制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用_蘸取少量的稀释液，在 MRS 乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是_。解析 从酸奶中分离乳酸菌时，可采用划线分离，方法是用接种环蘸取少量的稀释液，在MRS 乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。图示的划线分离中 B 图方
11、法是正确的，A 图不分区划线，但划线太稀疏了，分离效果很差，B、C、D 都采用了分区划线，但 C、D 都没有注意除第一区外，之后每区划线的第一条线都需要从上一区划线的末端开始。答案 接种环 B6本题组对应选修一 P19P28，微生物的利用1.大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，是基因工程技术中被广泛采用的工具。2.培养基是指微生物生存的环境和营养物质，一般都含有五大营养要素：即：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子。一般来讲， “细菌喜荤、霉菌喜素” ，大肠杆菌一般采用 LB 培养基，其主要成分为蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水等，若要扩大培养，则采用 LB 液体培养基，若要分离获得纯种，则采
12、用 LB 固体培养基，这两者的主要区别在于后者加入了琼脂。霉菌培养基一般用无机物配制成或添加蔗糖的豆芽汁。3.单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。常用的分离方式有划线分离法、涂布分离法两种。它们都采用固体平面培养基。其中涂布分离法单菌落更易分开，并且可用来计数菌体数目，但操作复杂些，且往往要先将培养的菌液稀释；而划线分离操作简单，但不能用于计数。4.菌种保存往往选用固体斜面培养基，于 4_冰箱中保存。用灼烧后的接种环从斜面取菌种时，往往要先使接种环接触培养基以达到冷却的目的，然后再取菌体。5.接种完成后应将培养皿倒置培养，目的是：防止水蒸气凝结成的水
13、滴落入培养基表面冲散菌落，影响单菌落的形成和分离。6.灭菌操作：培养基、培养皿、试管、三角瓶、枪头、接种环、镊子等用具通常用高压蒸汽灭菌，这些用具通常需要用牛皮纸或报纸包好，其中容器先要用棉塞或封口膜封口再包好，放入灭菌锅中，在 121 (1_kg/cm2压力)下灭菌 15 min。实验用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用 500 g/cm2压力(90 以上)灭菌30 min。由于尿素加热会分解，只能用 G6 玻璃砂漏斗过滤除菌，但玻璃砂漏斗使用前也要在 121 下用纸包好灭菌，用后还需用 1 mol/L 的 HCl 浸泡，
14、并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。将培养基转移到三角瓶和试管中时必须用三角漏斗，以免培养基沾到三角瓶口和试管口，发生污染。7.无菌操作通常在超净台中进行，超净台使用前 30 min，打开紫外灯和过滤风，注意打开紫外灯后人必须离开，使用时必须关闭紫外灯。角度 微生物的利用71.(2017嘉兴期末 节选)下列有关大肠杆菌的培养实验，请回答：(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和_作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的_。(2)大肠杆菌培养和分离的实验中，在_中进行扩大培养，培养液经_后，在LB 固体培养基上进行_
15、，并将培养皿_放在恒温培养箱中培养，可以获得如图效果。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及_，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。(3)通常对获得的纯菌种可以依据_的形状、大小等特征进行初步的鉴定。(4)关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中，下列叙述正确的是_。A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C.为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上解析 (1)配制培养细菌的培养基通常用 LB 培养基，其成分有蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水等，固体培养
16、基还有琼脂。其中蛋白胨、酵母提取物提供营养，NaCl 提供无机盐并调节渗透压，琼脂是凝固剂。(2)细菌培养通常用 LB 液体培养基进行扩大培养和生产，用固体培养基进行分离、鉴定、保存菌种。菌种分离有划线法和涂布法，进行涂布分离时，选稀释菌液，再进行涂布，完成后将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养，可获得分布均匀的单菌落。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及培养基灭菌是否彻底，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。(3)菌落的形状、大小等特征可以作为鉴定的依据。(4)高压灭菌加热结束后，自然冷却待压力表指针回到零后，开启锅盖，A 错误；倒平板时，应将打开上盖的一边，将培养基倒入培养皿，再盖上培养皿上盖，将培养
