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1、亲和反应及其在分离中的应用,王亚军 博士 College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology (浙江工业大学生环学院） Tel:88320379；E-mail: ,Email: 手机：13575738084 浙江工业大学生物工程研究所,Know me better,Yajun Wang Born in 06.14.1975. Graduated from Zhejiang Uni. Early in 2004. Conducted PostDoc research at
2、Cornell Uni., USA, 2006-2007. Associate Professor, 2006,亚胺培南,西司他丁,(3R,4R)-4-乙酰氧基-3-(1R)-叔丁基二甲基硅氧乙基-2-氮杂环丁酮,L-半胱氨酸,(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺,关键手性中间体技术,3.3.1 生物拆分法生产(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺,1. 腈水合酶催化()-2,2-二甲基环丙甲腈水合制备()-2,2-二甲基环丙甲酰胺； 2. R-酰胺酶拆分()-2,2-二甲基环丙甲酰胺制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺。,Researches at Cornell In US
3、Cell free protein synthesis system reconstitution,E. Coli A19,13 member ring,5 member ring,布雷菲德菌素A Brefeldin A,下游过程的成本,分离纯化 占总成本6090%,发酵生产乙醇回收成本仅占14% 青霉素生产回收成本约占50% 大多数酶的回收成本占70% 医用级酶如天门冬酰胺酶（asparaginase）纯化成本占85% 基因工程表达产物的回收成本一般占8590%以上,生化分离一般流程,生物分离工程的发展趋势,开发新型分离技术 分离单元操作集成化 .,A ligand that specifi
4、cally binds to a unique protein is linked to a solid support. Specific proteins bind to the ligand while other proteins pass through. The protein can be eluted by salts or changes in pH.,亲和层析 Affinity chromatography,亲合层析是利用各种生物亲合力（酶与底物，激素与受体，抗原与抗体）使蛋白质选择性的被固定相吸附。 上述作用对的一种物质，配基，被固定在固定相上，另一个物质，反配基（通常是
5、蛋白质），在过柱过程中被捕集。 亲合层析专一性、选择性非常高。,Affinity chromatography,Makes use of specific binding interactions between molecules,Examples of biological interactions used in Affinity Chromatography,将这些生物作用对中的一个物质固定在基质上，就可能开发成亲和层析介质。,Process of AC,用缓冲液平衡亲和介质。 样品中的目标分子被连接到亲和介质上，它们具有特异性吸附，但吸附是可逆的，可被洗脱下来。 改变洗脱液可将目标分
6、子洗脱下来，如通过改变pH值、离子强度、极性等。 亲和层析介质用缓冲液重新平衡。,亲和层析介质,+,+,=,Equilibrating, and Loading affinity column,Proteins sieve through matrix of affinity beads,Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly,Wash off proteins that do not bind,Wash off proteins that bind loosely,
7、Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of intere,亲和层析基质,琼脂糖 (Sepharose) 多孔玻璃或硅胶 (Porous glass) 聚丙烯酰胺 (Polyacrylamide) 丙烯酸酯类聚合物 (Polyacrylate) 纤维素 (Cellulose),用于亲和层析的支架主要有5类:,理想的亲和配基应该具有以下特征， 配基和目标蛋白必须能够形成可逆的复合物； 专一性必须适宜； 复合物结合常数（ 105-106 M）应当足够高以形成稳定的复合物，这样在层析过程中产生足够
8、的保留； 通过环境简单的变化就能容易的使复合物解离，对蛋白质、配基不产生可逆的影响； 亲和配基应具有良好的化学性质，能容易地固定到基质上。,亲和作用 (Affinity Interaction),酶的抑制剂,抑制酶活性的物质，就称为酶的抑制剂。几乎所有的蛋白质均存在相应的抑制剂。 在生物体内的酶的抑制剂可与酶的活性部位结合，抑制剂酶的活性，或者保护其它生物组织不受酶的损害，这类抑制剂与酶是一一对应的。 如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂: 胰脏蛋白酶抑制剂、卵粘蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。 小分子抑制剂：苄脒、精氨酸、赖氨酸。,抗体亲和层析,利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和析(Immunoaf
9、finity chromatography ，IAC)抗体与抗原之间具有高度特异结合能力。 以单克隆抗体为配基的免疫亲和层析法是高纯化蛋白质类生物大分子的有效手段，但价格昂贵，只能小规模应用。譬如，组织纤溶酶激活剂、干扰素。 利用多克隆抗体为配基时，只要选择适当的脱条件，也可进行目标产物的高度纯化。,金属螯合亲和层析-IMAC,过渡金属离子，如Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+等可与N、S和O等供电原子产生配位键，因此蛋白质表面的组氨酸(His)中的咪脞基、半胱氨酸(Cys)中的巯基，和色氨酸(Trp)的吲哚基，可与其发生亲和作用。 过渡金属与咪脞基的结合强弱能力顺序为： Cu2+ Ni2
10、+ Zn2+ Co2+ 。 过渡金属离子可通过亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成鳌合金属盐固定在固定相粒子的表面，用作亲和吸附蛋白质的配基。 有时也称其为金属鳌合层析(Metal chelate chromatography) ， 或固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography, IMAC)。,IMAC机理,对于欲使用A.C.分离的特定蛋白质，往往有几种可供选择的配基。除了1个明显使用的单克隆抗体以外，可以寻找天然的生物特异性作用对，如酶-底物（结构类似物），酶-辅因子（结构类似物），酶-抑制剂。对于糖蛋白，可以使用
11、固定化的凝集素。仿生染料具有更多样性的特异性。反配基固定到基质上，作用所需的结合常数Ka，对于大多数实际使用的，要超过或者等于105-106 M (对应的解离常数KD 1-10 M)。 KD是Ka的倒数。亲和作用强常常需要距离的、甚至变性条件来洗脱。结合常数Ka超过1010-1011M的往往不能使用，因为洗脱所需的条件可能与蛋白质变性条件一样。,间隔臂(Spacer),作用：减少亲和作用的空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物（68 C）：1. 乙二胺：NH2-CH2-CH2-NH22. 已二胺： NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH23. 6-氨基已酸：NH2-CH2
12、-CH2-CH2-CH2-COOH4. 环氧氯丙烷5. 1，4- 丁二醇缩水甘油醚,AF的吸附,吸附过程选择的条件要使配基和受体之间缔合趋势尽可能大，使配基与外部材料的结合趋势尽可能小。 通过调节一些参数，如离子强度、pH值和平衡缓冲液的化学组成、以及温度和流率等，可以实现最好的专一性吸附。 吸附的表观动力学通常很慢，应控制在低的流速。 如果固定化的配基和受体之间的相互作用比较弱，洗涤之前的预培育是必要的。,AF洗脱,Method 1 A change of buffer composition elutes the bound substance without harming either
13、 it or the ligand. Method 2 Extremes of pH or high concentrations of chaotropic agents are required for elution, but these may cause permanent or temporary damage. Methods 3 & 4 Specific elution by addition of a substance that competes for binding. These methods can enhance the specificity of media
14、that use group specific ligands.,咪唑环是组氨酸结构的一部分,组氨酸,咪唑,咪唑 (imidazole)竞争洗脱,亲和膜分离技术,膜分离过程概述,利用具有一定选择性透过的过滤介质进行物质分离的技术。 1854年发现透析（dialysis）现象； 1856 年发现天然膜的各向异性特性； 制造天然膜渗透器分离糖蜜和盐类； 1864年人造亚铁氰化铜膜诞生； 1930S发明硝酸纤维超滤膜； 1960S发明不对称反渗透膜； 1956年离子交换膜实现产业化； 1970年纳米膜问世。,膜分离过程的特性,膜分离的粒子范围,膜分离过程的分类,膜分离过程的分类,膜分离过程的分类,微
15、滤与超滤,微滤 特别适用于微生物、细胞碎片、微细沉淀物和其它在“微米级”范围的颗粒，如DNA和病毒等的截留和浓缩。 超滤 适用于分离、纯化和浓缩一些大分子物质，如溶液中与亲和聚合物相连的蛋白质(亲和超滤)、多糖、抗生素以及热源，也可以用来回收细胞和处理交替悬浊液。 微滤和超滤使用的膜都是微孔膜，作用原理是筛分效应。 微滤静压力差0.1-1105 Pa；超滤静压力差0.1-1106 Pa。 工业应用往往希望通过提高操作压力来提高膜处理量，故不断改性聚合膜材料性能，目前使用的聚合物超滤膜的最高操作压力差可达34.5105 Pa；无机材料的微滤和超滤膜操作压力通常是1.5105 Pa，在4106 P
16、a压力下会破碎。,分离膜的特性要求,为了实现高效膜分离，生物分离过程对膜材料有如下要求： 1.真正发挥过滤作用的有效膜厚度薄，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小； 2. 膜材料惰性，不吸附溶质（蛋白质、细胞等），这样膜不易污染，膜孔不易堵塞； 3使用的pH、T范围宽，耐受高温灭菌，耐酸碱洗涤剂，稳定性高，使用寿命长； 4. 容易通过清洗恢复透过性能； 5. 满足分离目的要求，如截留菌体细胞、截留或通过生物大分子等。,膜材料,目前，市售的膜主要材料包括：1. 天然高分子2. 合成聚合物3. 无机材料,浓差极化现象与膜污染,浓差极化（Concentration polarization）， 在超滤过程中，由于水透过膜，在膜表面的溶质浓度增高，形成浓度梯度，在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反的方向扩散，达到稳态时，在膜表面形成1个溶质浓度分布的边界层，该边界层的存在对水的通透起着阻碍作用。 膜污染 由于膜的劣化和水生物污垢引起膜使用后膜的通透流量迅速下降、溶质的截留率明显下降的现象。,
