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1、,植物体细胞杂交技术,周口师范学院生命科学系,植物体细胞杂交的意义,有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段。作用空间：主要限于种内的品种之间。种及种以上分类单位之间的杂交，例如种间或属间杂交，则常常遭遇有性不亲和性障碍。,在无性繁殖植物和性不育植物中，如在马铃薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是难以通过有性杂交进行遗传改良。因此，建立在原生质体全能性基础上的体细胞杂交和胞质杂交技术，对于植物的遗传改良具有重要的意义。,体细胞杂交（somatic hybridization):在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植株的过程。1972年，Carlson首次获得粉蓝烟
2、草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞杂种。,1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种“Potamato”。,去掉细胞壁,原生质体融合,体细胞杂交步骤：,1 原生质体的制备 2 原生质体的融合 3 杂种细胞选择 4 杂种细胞培养 5 由愈伤组织再生植株 6 杂种植株的鉴定,杂交的两个细胞,再生细胞壁,杂种细胞,脱分化,再分化,（植物体细胞融合完成的标志）,植物细胞融合,植物组织培养,2 原生质体融合,2.1自发融合 2.2 诱发融合 2.2.1 NaNO3处理 2.2.2 高PH-高浓度钙离子处理 2.2.3 PEG（聚乙二醇）处理 2.2.4 电
3、融合,2 原生质体融合,2.1自发融合在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体(homokaryon)，每个同核体包含240个核。形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。减少自发融合的措施：在用酶液处理之前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，切断胞间连丝。,2 原生质体融合,2.2 诱发融合2.2.1 NaNO3处理1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。缺点：异核体(heterokaryon)形成频率不高。,2 原生质体融合,2.2.2 高PH-高浓度钙离子处理1973年，Keller和Mel
4、chers，用强碱性(PH10.5)的高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。,2 原生质体融合,2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,2 原生质体融合,2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理PEG作为融合剂的优点
5、:异核体形成的频率高，可重复性强，对大多数细胞低毒；形成双核异核体的频率高。,2 原生质体融合,2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理据Burgess和Flenming（1974年）报道：在37下用高钙离子的强碱性溶液处理时，产生的聚集体 很大，每个包含很大原生质体。以PEG为融合剂时，多数聚集体包含23个原生质体。,2 原生质体融合,2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理融合基本过程,2 原生质体融合,2.2.3 PEG(聚乙二醇)处理注意事项：PEG的分子量 （MW 15006000） 酶溶液浓度原生质体来源PEG的稀释逐步进行在PEG溶液中，加入钙离子可以提高融合效率）,2 原生质体融合,2.2
6、.3 PEG(聚乙二醇)处理高温（3537）4%5%（V/V）的原生质体悬浮液所用酶种类和浓度，一般用崩溃酶。材料预培养融合地点（在离心管中，在小液滴中） 在PEG溶液中的保温时间太长会降低异核体形成频率。,2 原生质体融合,2.2.4 电融合将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融合小室中，小室两端有电极，在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，在两个电极间排列成串珠状。这时，如果有足够强度的电脉冲，就可以使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。,两个电极间串珠状原生质体,细胞电融合仪,2.3 融合产物的细胞学,在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。在双亲亲缘
7、关系较近的异核体中，两个核有可能同步进行第一次有丝分裂，而且在这个过程中，二者的染色体被一个共同的纺锤体所牵引，在有丝分裂末期形成两个杂种子细胞。最终分化出体细胞杂种，其核内具有双亲的染色体组。,2.3 融合产物的细胞学,在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中，两个来源不同的染色体组常常不能完全结合在一起。在动物体细胞杂种细胞系中，已知双亲之一的染色体会逐渐消除，在植物中也看到这种现象。,3 杂种细胞的选择系统,3.1 根据物理特性选择3.2 突变互补选择3.3 根据生长和再生能力的差别选择,3.1 根据物理特性选择,3.1.1 根据可见标志选择主要用于非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合。（
8、半绿半白） 3.1.2 根据荧光标记选择将2种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，然后通过荧光显微镜鉴别异核体。 3.1.3 低密度植板选择对细胞进行追踪选择。,3.2 突变互补选择,3.2.1 隐性突变互补选择 3.2.2 显性抗性互补选择 3.2.3 隐性突变与野生型互补选择 3.2.4 显-隐性双突变体选择,3.3 根据生长和再生能力的差别选择,3.3.1 根据愈伤组织生长差别选择3.3.2 植株再生能力的差别选择3.3.3 根据生长和分化对培养基要求的差别选择,3.3 根据生长和再生能力的差别选择,3.3.1 根据愈伤组织生长差别选择在曼陀罗和烟草种间体细胞杂交以及在小麦和某些其他禾
9、谷类植物属间体细胞杂交中，发现杂种愈伤组织表现生长优势现象，因此融合处理后只要挑选生长快、长的最大的愈伤组织，就会从中分化出体细胞杂种。,3.3 根据生长和再生能力的差别选择,3.3.2 植株再生能力的差别选择不同来源的原生质体分化再生植株的能力不同。在体细胞杂交中，只要有一个亲本的原生质体能够再生植株，融合产生的杂种细胞就能再生植株。,3.3 根据生长和再生能力的差别选择,3.3.3 根据生长和分化对培养基要求的差别选择不同来源的原生质体对培养基成分和激素的要求不同。设计的培养基只有杂种细胞能够生长。,4 胞质杂交和胞质杂种,有性杂交，细胞质基因组来源于母本。体细胞杂交，杂种有两个亲本的细胞
10、质基因组。 胞质杂种(cybrid):两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起。 核质杂种(nucleo-cytoplasmic hybrid):一个亲本的细胞核与另一个亲本的细胞质基因组结合。,4 胞质杂交和胞质杂种,获得胞质杂种的方法：常先把异种胞质供体物种原生质体的核灭活，然后再将它与异种胞质受体物种的原生质体融合。 通过射线辐照灭活胞质供体细胞核 胞质体和原生质体的融合,4 胞质杂交和胞质杂种,通过射线辐照灭活胞质供体细胞核阻止没融合的胞质供体细胞的分裂，细胞核部分或完全失活。阻止没融合的受体细胞的分裂胞质体和原生质体的融合利用细胞质供体细胞的去核原生质体与受
11、体亲本的完整原生质体融合。,5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定,5.1 形态和育性鉴定 5.2 细胞学和分子细胞学鉴定 5.3 生化鉴定 5.4 分子生物学鉴定,5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定,5.1 形态和育性鉴定株型、叶形、花形，茎、叶茸毛的有无或多或少有双亲的特点育性取决于双亲亲缘关系的远近，杂种或是育性很低，或是完全不育。,5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定,5.2 细胞学和分子细胞学鉴定通过确定杂种染色体数和染色体形态,5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定,5.3 生化鉴定同工酶谱分析法：将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱比较：杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和 可能只出现双亲的部分酶带或缺少
12、双亲的某些酶谱而出现新的谱带。,5 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定,5.4 分子生物学鉴定RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA) AFLP ( Amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性) SRAP(sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性) SSR （Simple sequence repeat，简单序列重复）,6 体细胞杂种在农业生产上的应用,6.1 对无性繁殖植物或性不育植物进行遗传重组对2个不能进行有性繁殖的物种之间实现遗传重组，体细胞融合目前看来是唯一途径。性不育植物（单倍体、三倍体和非整倍体），融合后产生可育的二倍体或多倍体。,6 体细胞杂种在农业生产上的应用,6.2 克服有性不亲和性障碍由于存在不亲和障碍，种间或属间有性杂交虽能进行，但难以产生杂种，而通过体细胞融合，有可能突破有性杂交的这种局限性。,6 体细胞杂种在农业生产上的应用,6.3 细胞质遗传性状的转移细胞质雄性不育（cms）性状的转移转移由细胞质基因控制的重要农艺性状，如光和速率、对高温和低温的耐性，以及抗病性和抗除草剂特性等。,
