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1、1,第三节 生物化学方法 及其在中医研究中的应用,2,本节的教学目的和要求：1掌握生物化学实验研究方法的特点和优势。2掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的生物化学实验技术和综合多种技术。3了解生物化学的主要方法及其在中医研究中的应用。,3,什么是生物化学？生物化学是运用化学的理论和方法来研究组成生物体的基本成分及其分子的组成、结构、性质、功能、相互关系，以及在生命活动中化学变化规律的一门学科。因此，生物化学是研究生命的化学，是一门实验性学科。当代有人建议改作化学生物学。,4,生物化学是在有机化学和生理学的基础上建立和发展起来的，在20世纪初期成为一门独立的学科。现代生命科学的许多基本知识来自
2、于该领域，如糖类、脂类和蛋白质类，酶、激素、核酸；化学反应，发酵、分解、合成、氧化、代谢、能量，动态平衡；分子的结构与功能；蛋白质和核酸的分子化学合成等等。生物化学经历了静态生化、动态生化和机能生化3个阶段。我国古代虽无生物化学这个名词，但有丰富的生物化学知识和实践。在漫长的叙述生物化学阶段，有着辉煌的一页。早在公元前2l世纪，我国人民已能发酵造酒、作酱、饴糖。雀目、脚气病、瘿病，紫河车、水蛭。,5,一、生物化学的主要方法生物化学的主要方法有哪些？ 生物化学的基本方法主要有物质的分离、提纯法，光谱法，层析法，电泳法，离心法，以及新近发展的微量分析技术、高效分析技术等。 与教材其它几类实验技术相
3、比，常用生物化学技术的显著特点是定量分析和检测某一物质。涉及糖、脂肪、蛋白、酶，以及各种分子。,6,（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子物质的分离和提纯过程主要有哪些环节？生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。,7,生物大分子的分离提纯过程可分为以下6个阶段：1材料选择原则是选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的材料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要注意取材新鲜，要进行预处理，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进行，防止生物大分子的变性、失活。,8,2细胞破碎生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据材料来源及实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超
4、声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。在细胞破碎时，如何选择匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎等方法？ 匀浆器研磨：适用于大多组织，但速度较慢，组织量较少。 高速组织捣碎器：适用于大多组织，速度快；但易破坏大分子。 反复冻融：适用于培养的细胞。,9, 超声波破碎：适用于培养的细胞，速度快。 酶消化：适用于特定的组织。,不同型号的超声波破碎仪,10,3亚细胞器的分离各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例如DNA几乎全部在细胞核中，电子传递链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网（微粒体）上，Na+-K+-ATP酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分离
5、亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分离，一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。,11,4提取提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。,12,5分离纯化生物化学分离纯化的技术主要有哪些？刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀、等电点沉淀、盐析、层析、电泳
6、、超离心、吸附、结晶等方法。,13,6浓缩、干燥及保存经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保存，有时还需加入防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。,真空冷凝干燥仪 超低温冰箱,14,（二）离心技术离心技术适用于分离哪些物质？试举例说明。离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。适用于分离悬浮颗粒细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。如分离血细胞、大肠杆菌等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动
7、，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。,15,冷冻离心机构造图,16,左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。,17,左图：不同离心机的不同转头右图：超速离心机的不同转头,18,常用的离心机有多种类型，一般： 低速离心机 的最高转速不超过6000rpm。 高速离心机 在25000rpm以下。 超速离心机 的最高速度达30000rpm以上。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：1差速离心法通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。,19,2密度梯度离心法离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗
8、糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：（1）速度区带离心法：离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。,20,（2）预制梯度等密度离心法：要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需加在
9、梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。,21,（3）自成梯度等密度离心法：某些密度介质经过离心后会自成梯度，如Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。,22,3沉降平衡离心法根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质
10、起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。,23,（三）层析技术层析法的基本原理是什么？层析法又称色谱法，是目前广泛应用的一类分离分析技术。它是利用混合物各组分理化性质上的差异，例如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小、亲和力等，使各组分以不同程度分布在2个相中，其中一个为固定相，另一个为流动相，当混合物随流动相通过固定相时，由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同，而使各组分移动速度各异，以达到分离的目的。,24,层析法根据其分离的原理可划分哪几种层析？1根据分离的原理划分吸附层析与亲和层析有何异同？
11、（1）吸附层析：是利用混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，因吸附剂对各组分的吸附能力的不同，而使各组分流动速度不同，将各组分分离。吸附层析根据支持物装填方式的不同有柱层析和薄层层析类，前者常用于分离非极性或极性较小的有机物，后者用于分离氨基酸、类固醇激素等。,25,（2）分配层析：利用混合物随流动相（非极性溶剂）通过含极性溶剂的载体组成的固定相时，由于各组分在二相中的分配系数的不同，而使混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开。分配层析应用最广泛的是纸层析。（3）离子交换层析：离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，离子交换剂是一类具有酸性或碱性基团，能与溶液中的阳离子或阴离子发
12、生交换的不溶性物质，流动相通常是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。将混合溶液加入离子交换柱，由于离子交换剂对混合液中各种离子具有不同的亲和力而产生不同的吸附作用，当流动相流经离子交换柱时，可以降低离子交换剂对吸附离子的亲和力而被交换洗脱下来，从而达到分离的目的。,26,（4）凝胶层析：以多孔性网状结构的凝胶（葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶等）为固定相装柱，将分子量大小不同的混合组分加入柱，用一种洗脱液作为流动相进行洗脱。小分子物质易进入凝胶颗粒内部使流程延长，大分子物质不能进入凝胶颗粒内而被排阻在外，流程较短，经过一定洗脱时间后，可将混合物按分子大小不同分离开来。,27,28,
13、（5）亲和层析：亲和层析是根据生物大分子与其配基之间具有高度专一性的亲和力而设计的一种层析技术。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：酶与底物（包括辅酶与辅基）、激素与受体、抗原与抗体、DNA与RNA、凝集素与糖蛋白等。由于结合双方是互配的，因此分子对任何一方均可作为配基，通过化学法连接到载体上作为固定相装柱，将欲分离的混合物（分子对另一方）加入柱，由于分子对双方有高度亲和力而被吸附结合在柱上，其他杂质首先随流动相被洗脱下来，然后改变流动相成分，将吸附结合在柱上的亲合分子洗脱下来。,29,2根据两相物理状态划分（1）液相层析：流动相为液体的层析，如上述各种层析。,低压液相层析仪,30,（2）气相
14、层析：流动相为气体的层析。固定相有固体或液体，故又分作气固层析或气液层析。3根据支持物的装填方式划分（1）柱层析（将支持物装在管子中成柱形，在柱中进行层析）。（2）薄层层析（支持物铺在玻璃板上成一薄层，在薄层上进行层析）。（3）纸层析（用纸做支持物的层析）。,31,4高效液相技术什么是高效液相技术？高效液相（HPLC）技术是液相层析微量、高效化的发展。HPLC是一种高效的液相层析技术，具有高速、高压、高效、高灵敏度等特点。依据样品的性质可选择不同的色谱柱、洗脱条件、检测器（紫外、荧光、电化学、示差等），还可将被检测物流出液分类收集。,32,上图：高效液相仪 右上图：高效液相结果 左下图：色谱柱
15、,33,（四）电泳技术电泳的原理是什么？带电颗粒在电场作用下，向着其电性相反方向移动的现象称为电泳。由于被分离物质各自的带电性、带电量、分子颗粒大小和形状等的不同，在同一电场下它们的移动速度各异，经过一定时间电泳后可被分离开来。在电泳过程中，带电颗粒的迁移率在一定条件下与其所带电量、颗粒半径和溶液的黏度相关。此外还有以下因素可以影响物质的电泳迁移率：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用等。,34,1区带电泳所谓区带电泳是指在电场作用下，被分离的各组分在支持物上相互分离为不同的区带。分类如下：（1）按支持物的物理性状不同可分为： 凝胶电泳，该电泳方法使用最为普遍； 滤纸及其他纤维纸电
16、泳； 粉末电泳； 缘线电泳。,35,（2）按支持物的装置形式不同可分为： 平板式电泳； 垂直板式电泳； 柱式电泳； 连续液动电泳。（3）按pH的连续性不同可分为： 连续pH电泳； 非连续pH电泳。,36,左上：电泳结果左下：垂直电泳架右：双向电泳结果,37,凝胶成像系统,38,2高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）高效毛细管电泳与普通凝胶电泳的区别在哪？HPCE是离子或荷电粒子以高压电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳技术。它具有高效（每米理论塔板数在105以上）、快速（分离时间一般小于30min）、进样体积小（一般为nl级）、灵敏度高、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点。应用范围包括无机离子、有机分子、生物大分子如糖、核酸、多肽和蛋白质等的分析。,39,不同型号的毛细管电泳仪及其工作原理,
