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1、基 因 诊 断 与 基 因 治 疗,基因诊断的概念,基因是遗传学上的一个概念，是在染色体上占有一定的位置，表现一定功能的基本单位 基因的物质基础是脱氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA） 基因诊断是指运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达产物，是目前诊断技术中最具发展前途的技术。,基因诊断的分子生物学基础,基因诊断操作的对象为基因或其片段 运用现代分子生物学和分子遗传学方法，检查特定基因的存在与否、基因的结构及其表达功能是否正常等，从而确定： 是否患有某种遗传病：成年人遗传型分析，产前诊断 是否患有某些特定的微生物感染疾病 是否患有某种肿瘤，对肿瘤病人的预后
2、进行分析 基因配型，用于移植、输血等 法医学上，分析犯罪现场的证实与嫌犯的鉴别,基因诊断的途径,检查是否存在特定的DNA或RNA，用于微生物感染的诊断 基因突变的检测 限制性内切酶酶谱分析 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法 基因连锁分析 限制性片段长度多态性分析(RFLP) 基因的单碱基多态性分析(SNP) 基因转录产物mRNA检测 基因型的鉴定与比较,基因诊断的对象,1、病原生物的侵入：一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查各免疫学方法进行诊断。直接检测病原生物的遗传物质提高诊断的敏感性 2、先天遗传性疾患：已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。例如：苯丙氨酸羟化酶基因突
3、变可引起苯丙酮尿症：腺苷脱胺酶基因突变可引起重症联合免疫缺陷症（SCID)；而淋巴细胞表面分子CD40或其配体（CD40L）基因突变则可引起无丙种球蛋白血症。用基因诊断的方法检测其基因突变利于确诊和治疗方案的建立 3、后天基因突变引起的疾病：肿瘤。肿瘤的发生是由于个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。基因诊断可确定抑癌基因发生突变还是癌基因发生突变 4、其它：如DNA指纹、个体识别，亲子关系识别，法医物证等,基因诊断的运用,一是通过检测特定基因或相关疾病基因的存在以判断和评估某疾病在某一个体上发生某疾病的风险，以导向预防这种疾病的发生 二是通过基因诊断促使个性化药物的诞生 三是通过基因诊断更精
4、确判断某些传染性疾病或肿瘤等疾病的存在，以有利于临床医生尽早确定病因 基因诊断技术不仅在疾病检测上具有重要意义，而且在婚前检查，亲子鉴定等人类生活方面具备广阔运用前景,基因诊断的方法,PCR 核酸杂交 基因芯片(chip) 扩增片段长度多态性(Amp-FLP) 等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法(ASO) 单链构象多态性诊断法 (SSCP),PCR技术的发明及特点,1985年Saiki 首次用以扩增珠蛋白基因标志PCR技术的问世。PCR技术具有简便、快速、特异和灵敏等特点，它用于基因诊断，使之发生了革命性的变化。 PCR技术可使待测样品中的目的基因片段在几小时内，甚至十几秒内扩增百万倍，如果标本
5、中原来的目的基因达到fg级水平，就可以通过简单电泳和溴化乙啶(EB)显示扩增后的核酸片段区带。从检测区带的电泳位置看它是否符合引物设计的扩增长度。,PCR技术的进展,PCR-Southern印迹 模板检测灵敏度可达ag级水平(可查出几个病毒的存在)则能看到杂交带。特点：特异性强，但操作费时间，一次需3d，这使急于根据检测结果决定治疗措施的临床医生迫不及待。 套式PCR 是指在用第一对引物(外引物)扩增之后，加入另一对位于外引物内侧的内引物，再行扩增数十个循环，这可将标志检测时间压缩8-10h，第2日便可获得高敏感性的检查结果。其敏感性大致与PCR-Southern印迹相当。,PCR的微量化 反
6、应体积减少至10-20l，降低了PCR检测的成本。在1次PCR中加入多对引物，可用于病毒、细菌等的分型和多种病原体基因的检测。PCR扩增产物，用专为检测双链DNA而设计的微量荧光计定量，就可从标准模板DNA的量或拷贝数达到PCR定量的目的。取样技术的改进 对于产前诊断，初期是取羊水细胞，需进行细胞培养。从1982年起采取妊娠8-12周的绒毛DNA作产前诊断使产前基因诊断的时间提前。由于PCR技术的应用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可作产前诊断。,反向遗传学策略 过去寻找致病基因是从经典遗传学思路出发，先发现疾病的表现改变，再经过不同方法由表型追溯到基因。 近几年来发展起来的“反向遗传学”(r
7、everse genetics)在策略上解决了经典遗传学所不能解决的这个难题。在不知道和不必知道基因产物或表型的情况下分离和定位致病基因，并由它的一级结构推出产物的氨基酸序列。 方法：须先采用细胞遗传学方式或RFLP连锁分析确定致病基因在染色体上的大概位置，然后采用染色体步移（chromosome walking）或染色体跳跃（chromosome hopping）技术逐渐接近，最后找到的基因的准确位置。 成功例子：如Duchenne肌营养不良和囊性纤维变等致病基因的发现；预计亨廷顿舞蹈病、神经纤维瘤、多发性肠息肉和成人型多囊肾等疾病的致病基因，不久可望用此策略得以确定。,核酸杂交概念,不同来
8、源的DNA加热变性后，只要两条多核苷酸链的碱基有一定数量能彼此互补，就可以经退火处理复性现象，形成新的杂交体双螺旋结构，这种依据相应碱基配对而使不完全互补的两条链相互结合称为分子杂交。,核酸杂交分类,基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类 根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类 DNA探针还有单链和双链之分,核酸探针的标记和检测,核酸探针的常用酶促标记技术 缺口平移 DNA快速末端标记 用T4多核苷酸酶标记DNA 5末端，随引物延伸 聚合酶链反应 核酸探针的非放射性标记技术 光促生物素标记核酸 酶促生物素标记
9、核酸 寡核苷酸的生物素末端标记 酶标DNA 酶标寡核苷酸 DNA半抗原标记,核酸分子杂交方法,核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。,基因芯片概念,也叫DNA芯片，是在90年代中期发展出来的高科技产物。基因芯片大小如指甲盖一般，其基质一般是经过处理后的玻璃片。每个芯片的基面上都可划分出数万至数百万个小区。在指定的小区内，可固定大量具有特定功能、长约20个碱基序列的分子探针。,基因芯片
10、的原理及用途,原理：由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列，利用分子杂交及平行处理原理，基因芯片可对遗传物质进行分子检测 可用于进行基因研究、法医鉴定、疾病检测和药物筛选等 特点：基因芯片技术具有无可比拟的高效、快速和多参量特点，是在传统的生物技术如检测、杂交、分型和DNA测序技术等方面的一次重大创新和飞跃,基因芯片应用,基因破译 ：基因功能；提高测序速度 基因诊断 ：癌症、糖尿病等，借助一小滴测试液，医生们能预测药物对病人的功效，可诊断出药物在治疗过程中的不良反应，还能当场鉴别出病人受到了何种细菌、病毒或其他微生物的感染。,扩增片段长度多态性,概念：小卫星DNA和微卫星DNA的长度多
11、态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）连锁分析法。 方法：PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。,等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide, ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。 用于探测点
12、突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。 PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,单链构象多态性诊断法,单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这
13、种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或突变的检测。 用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据此作出诊断。 PCRSSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。,基因诊断的质量控制,特异性：杂交技术是通过基因克隆制备探针来完成，PCR是通过引物来完成，RFLP是利用限制内切酶来完成等。即探针、引物、限制性内切酶在反应中都具有
14、特异性。 灵敏度：杂交技术用同位素或酶标记探针，PCR反复扩增20-30次都是提高灵敏度的手段。二次PCR、PCR与Southern blot合用都是典型的例子。 操作简单：杂交技术因操作复杂且费时（需1-2天以上出结果），在临床实验室难以推广。而PCR方法相对简单、快速，故推广迅速。 实验成本：分子生物学实验因试剂多数依赖进口，成本高，给临床推广造成一定困难。试剂国产化是今后的努力方向。 重复性和稳定性,基因诊断的应用,感染性疾病 病毒性疾病的诊断：HBV、HCV、HIV和HPV 细菌性疾病的诊断：TB、疟原虫 遗传性疾病 镰刀状细胞贫血症：beta-珠蛋白基因AT变换 甲型血友病：凝血因子
15、VIII 肿瘤ras癌基因突变、c-myc癌基因p53抑癌基因、p16抑癌基因 产前诊断、移植配型 法医鉴定,基因诊断的意义,一是可以解决遗传性疾病难以诊断的黑洞，由于遗传性疾病主要是由特定的DNA序列即基因决定的，通过基因诊断能够在遗传病患者还未发现出任何症状之前就能确诊 二是肝炎、癌症、艾滋病都与病毒有关，而通过基因诊断技术就可以顺利检查出隐藏在人体细胞基因中的病毒从而在造成危害之前消灭它们。,基因治疗 (Gene Therapy)的概念,人类疾病的发生，是人体细胞中自身基因的改变，是由外源病原体的基因产物与人体基因相互作用的结果。因此，长期以来，科学家设想人类能否最终运用遗传物质，无论是
16、人类自身的或是外源遗传物质来治疗疾病，纠正人体本身基因结构或功能上的错乱，阻止病菌的 ，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，保证人体健康。基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，他们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前基因治疗的概念有了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。,基因治疗的潜力,基因治疗的历史沿革1990年，科学家第一次用反转录病毒为载体，把腺苷脱氨酶基因（ADA）导入来自病人自身的T淋巴细胞，经扩增后输回患者体内，获得可成功。标志着基因治疗时代的开始。1995年美国FDA批准AdP53肿瘤基因治疗等临床试验的实施，标志着基因治疗已逐步进入一个正常的、目标明确的理性化发展阶段。,
