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1、华勃氏呼吸计法测定L-谷氨酸,实验目的,了解华勃氏呼吸仪测定气体变化的原理。 掌握华勃氏呼吸仪测定气体变化的具体操作。,实验原理,华勃氏呼吸计法基本原理是在一密闭的、定温定体积的系统中进行样品气体变化的测定。当气体被吸收时，反应瓶中气体分子减少，压力降低；反之，产生气体时，压力则上升，此压力的变化可在测压计上表现出来，由此可利用气体定律计算出产生的CO2或吸收O2的量。此法可用于细胞、线粒体等耗氧速率和发酵作用的测定，也可进行研究其他有关和O2和CO2气体交换反应，如呼吸作用、光合作用、脱羧酶和氧化酶的活性等。 大肠杆菌菌体内含有L-谷氨酸脱羧酶，能专一地催化L-谷氨酸脱羧，释放出二氧化碳。利
2、用华勃氏呼吸仪测定并计算出二氧化碳量后，可进一步求出L-谷氨酸含量。,仪器、原料和试剂,仪器：移液管2ml、0.5ml、0.2ml、0.1ml；2ml注射器；瓦氏呼吸仪1套。 原料： （1）大肠杆菌-丙酮粉的制备：将纯化的大肠杆菌由试管斜面培养接种到10支200ml茄形瓶培养基上，于37培养1618h。 （2）培养基的配方如下： 蛋白：10g 牛肉膏浓缩液：5g 琼脂：20g 蒸馏水：1000ml 每一茄形瓶加入少量0.9%氯化钠溶液，洗下菌体（可洗二次），菌体悬液离心（2500r/min）弃去上清夜，沉淀（菌体）悬浮于少量生理盐水中，置冰箱中冷却至20。 向已冷却的菌体悬液中加入10倍体积的
3、冷丙酮（-10），边加边搅拌10min，静置，待菌体沉淀后，倾去上清夜，菌体用布氏漏斗抽滤，并用冷丙酮洗菌体1次，滤液置于干燥器内减压干燥，所得大肠杆菌-丙酮粉装于密封瓶内，冰箱保存，数日内有效（现制备的要放入冰箱40h后，取出研磨粉备用）,试剂： 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）： A液：3mol/L乙酸钠溶液。称取CH3COONa3H2O（相对分子量136.09）40.8g溶于蒸馏水中，然后定容至100ml。 B液：2mol/L乙酸溶液。称取12g乙酸加蒸馏水定容至100ml。 将A、B两液按7：3（体积比）混合即得，使用时事先用pH计校正。 0.5mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0
4、）：称取30g冰乙酸加入12g CH3COONa3H2O，溶解后放入100ml定量瓶中，用蒸馏水稀释至 刻度。也可用3mol/L乙酸缓冲液稀释制得。 2%大肠杆菌-脱羧酶液：称取2g大肠杆菌-脱羧酶-丙酮粉，用pH5.0 0.5mol/L的乙酸缓冲液定容至100mL。 0.05mol/L L-谷氨酸溶液：准确称取L-谷氨酸0.7360g，用蒸馏水定容至100ml。 检压液（或称布洛的氏溶液）：称取NaCl 23g，牛胆酸钠5g，伊文氏蓝0.1g（相对分子质量960.83）（如没有，可以用0.1g甲基蓝或酸性品红代替）。混合后再加麝香草酚蓝酒精溶液数滴（防腐）（1g麝香草酚蓝溶于100ml 40
5、%酒精中），用蒸馏水定容至500ml，相对密度为1.033，使用前需校正，若相对密度高于1.033时用蒸馏水调，低时用NaCl调。,实验步骤,1将测压管固定于铁架上，放松螺旋压板，用注射器在橡皮管内加入检压液至刻度50mm处。 2按下表在反应瓶中加入各试剂。反应瓶侧管瓶塞和压力计三通塞均涂以凡士林后塞紧。压力计口亦涂上凡士林和反应瓶连接，轻轻转动反应瓶，使封口凡士林呈透明，然后用橡皮筋将反应瓶固定在压力计上。,3在水箱内加入温水至水箱上部6cm处，调节水银触点温度计至37。打开电源开关和加热开关，升温至酶反应温度37。 4将两副压力计固定在水槽上，使反应瓶进入水浴中。保温振荡10min（120
6、转/ min），当反应瓶内温度与水槽温度平衡后，关闭三通活塞，调节螺旋夹，使左右两侧检测液面高度不同（左侧开口端液面约在230mm处），记录液面高度，10min后检查液面是否发生变化。如无变化，表示测压计不漏气，可以开始测定。 5转动三通活塞，使与大气相通，调节螺旋夹，使右侧（闭管，但此时与大气相通）管内液面在150mm处（参比点），记录左侧（开口端）液面高度，此为反应前读数，关闭三通活塞。,6用左手食指堵住测压管左侧口，取出测压装置，将反应瓶侧室中的酶液倾入主室中，摇匀（注意勿使液体堵住气体出口），立即放回水槽中，并放开食指，将右管液面调节在150mm处。 7开始振荡15min后，将压力计的
7、右管液面调至150mm处，记录测压计左管液面高度，继续再振荡几分钟，重复将压力计的右管液面调至150mm处，记录测压计左管液面高度，当读数不再变化时的读数为终读数。 8测量完成后先打开压力计三通活塞，再取下压力计和反应瓶。关闭仪器的各个开关。,计算,L-谷氨酸含量= （V 147130）/22400000 10n（mg/mL） = （V /152）10n V=h2K2-h1K1 h2=h2-h1, h1=h2-h1 式中 h1-样品瓶初读数，mm液柱； h2样品瓶终读数，mm液柱； h1对照瓶初读数，mm液柱； h2对照瓶终读数，mm液柱； K1样品反应瓶常数，L/ mm液柱； K2样品反应瓶常数，L/ mm液柱； n样品稀释倍数； 100.1ml样品换算成1ml； 147130谷氨酸的摩尔质量（ml/mol）； 22400001mol谷氨酸脱羧放出CO2的体积（L）（标准情况下）,注意事项,检压液注射时要避免液柱内产生气泡。 反应瓶与测压管是配套的，使用时勿弄错。,思考题,华勃氏呼吸计的测定原理是什么？ 实验过程中为减少实验误差需要注意哪些操作？,
