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1、酶工程技术,大自然的多样性与酶的多样性酶反应的特征酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。温和，高效，专一,西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。,酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此
2、区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。,一、固定化酶(细胞)的制备方法,(一) 吸附法 （二）包埋法 （三）共价结合（偶联）法 （四）交联法,吸附法包埋法 共价结合法交联法,(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。,根据吸附剂的特点又分为两种：,物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。常
3、用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。 离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度 条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的 相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。,影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素: 1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸
4、附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小 和总吸附面积的大小。,吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的
5、氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。,吸附法的优点、缺点,（二）、包埋法,凝胶包埋法（胶格包埋法）： 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺
6、法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。,微囊化包埋法,微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用 。 微囊制备方法 （1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 （2）界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。 （3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。,包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是
7、只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。,包埋法的优点、缺点,（三）、共价结合（偶联）法 共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。,共价偶联法中的几个影响因素 （ 1 ）载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 （ 2 ）偶联反应的反应条件必须在温
8、和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 （ 3 ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。 （ 4 ）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。,（1）共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。 （2）共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。,（四）、交联法共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三维的交联网状结构,交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体
9、间进行交联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。 能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。,共价交联法的四种形式：（1）酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。,（ 2 ）酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白
10、蛋白、明胶、血红蛋白等。,（3）吸附交联法：此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。,（4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。,四种固定化酶制备方法的特点小结,制法,特性,1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价,固定化方法与载体的选择,固定化细胞,固定化细胞是指直接将细胞固定在水不溶性载体上，在一定的
11、空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。固定化细胞的优点：1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体。 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或 连续使用。3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。,（八）固定化酶(细胞）应用实例,二、固定化酶（细胞）的性质 有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。 固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。 酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可以再生。 能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生
12、产的管道化、连续化与自动化提供了可能。,影响固定化酶（细胞）性质的因素,酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应： 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应,1、分配效应由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。,2、空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶
13、的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。,3、扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。 载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因
14、。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。,（二）、固定化酶（细胞）性质的改变1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。 包埋法时被高分子物质半透膜包围。,2、固定化后酶稳定性提高稳定性提高的原因： 固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起
15、作用的酶变性后才起作用。 抑制自降解，提高了酶稳定性。,3、固定化酶（细胞）的作用pH变化酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。,4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。,微生物转化,微生物转化，（生物转化biotransformation, bioconversion）微生物的生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，作用于一些化合物的
16、特定部位（基团），使它转变成结构相类似但具有更大经济价值的化合物的生化反应。利用的是完整细胞中的酶的活性。这些细胞可以是活的细胞正在生长的或静态的（细胞分裂很少或根本没有）细胞，也能使用干细胞或孢子。,微生物转化与化学过程相比的优点：,微生物转化在温和的条件下进行，化学物质转变成要求的产品，不产生分解，而且节约能源和投资； 微生物转化作用于基质分子的专一位置，产生立体专一性、光学专一性产物，不需要化学拆分。,微生物转化的发展：,20世纪40年代，微生物转化领域的研究蓬勃兴起 首先在甾体转化方面取得巨大成功，并建立了工业规模的甾体激素转化操作 微生物转化在其他种类生理活性化合物如生物碱、抗生素、大麻油和前列腺素合成上也得以应用。,微生物转化一般过程,（1）制备培养系统（催化剂） （2）加入底物 （3）加入效应物（抑制剂或激活剂） （4）保温反应 （5）监测反应过程 （6）终止反应 （7）产物分离,
